核酸碱基薄层层析及双波色谱扫描分析准确度验证

互联网2013-09-06

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核酸组成成分及衍生物的分析除常用的电泳、纸层析和薄层层析洗脱比色法外，近年来又出现了双波长色谱扫描法和高压液相层析法。但已报道的双波长色谱扫描法测定的碱基种类不多，在测定DNA (G + C)克分子外方面，尚未见报道。我们在实验中摸索出分离核酸碱基效果好的硅胶薄层析，并考查了双波长色谱扫描分析法的准确度。

材料和方法

(一)主要试剂及仪器

1.试剂碱基A, G, C, T 和U，均为层析纯，含量>98多;A, U德国产，C为BDH产，G, T分别为上海东海制药厂和恒信化工厂产。小牛胸腺DNA为上海牛奶公司产。薄层层析用硅胶H,为青岛海洋化工厂产。薄层层

析用纤维素(Cell ulo sepulverM N300UV254)，德国产。狡甲基纤维素钠为上海化学试剂厂产。

其他试剂为AR，水为重蒸水。

2.仪器日本岛律CS-910双波长色谱扫描仪。

(二)分析方法

1.薄层层析分离 (1)制板：取16.28硅胶H, 1.8 g MN30OUV 254纤维素，0.5外挟甲基纤维素钠(离心去除悬浮物)90ml，于匀浆器中匀浆5分钟，速度以浆液不溅出为度，抽气，均匀涂布在6块20× l 0 cm或4块20×1 5cm的平整清洁的玻板上。

(2)薄层分离：称取25X103nM (1nM二10-9 M)A ,G ,C ,T ,U ,盛于不同容器中，再分别称取同样量的上述各碱基混合于一个容器，各加Im l水，1滴12N NaOH 液助溶，后加1滴浓HCl，用0.1 N HCI稀释到5m1。将上述硅胶薄层板于105℃活化半小时，按常法把单个及混合的碱基溶液分别点在不同的点上，用饱和正丁醇上行展开至前沿12cm 处取出，时间1.5小时。层析后风千或吹干，于254nm紫外灯上定位，画出各碱基斑点的位置，计算

Rf值。

2. DNA 碱基定量分析

(1)标准曲线绘制：准确称取并按上法配成各种碱基浓度为5nM/μl的A, G, C, T标准碱基混合液，取活化的3块20× 10cm硅胶板，每板点5点，分别为1,2,3,4,5冈，按前层析，用CS-910双波长色谱扫描仪测定。测定条件：λS=265nm, λR=370nm，反射法，线性扫描。用量高法计积分值，将各板中种类和含量均相同的碱基之积分值加和平均，求各碱基积分值和nM 之间关系的回归方程，作出以积分值(任意单位)为Y, nM 为X的回归直线，即为标准曲线。

(2)样品测定：加2 mg DNA样品和2m188多甲酸于GG 17玻璃制的2m1安瓶中，按Aaron Bendicht4，法水解，依标准碱基溶液配法溶成0.2m1样品液。取不同量的样品液与3μl标准碱基混合液点于同板的不同点上，层析和扫描测定后，选取积分值与标品积分值相差不大的样品量作为测定点样量。取3块薄层板，每板点标品3μl，共3点，样品按预测量点样，亦为3点，照前层析和扫描，分别求出各板中标品和样品相应碱基积分值的平均值，在相应碱基标准曲线上找出标品积分值和15nM 所在的点，从该点推出标准曲线的平行线，即校正曲线，其上由样品积分值对应的X值就是样品的nM数。如果样品和标品积分值接近，也可由样品rim二样品积分值X15"标品积分值，直接算出来。

就得到分析结果。把3块薄层板测得的上述数值平均，便是该DNA的碱基组成。

结果和讨论

(一)碱甚菠层层析结果

如表1和图1示。对于核酸碱基薄层层析分离，大多数文献是使用纤维素板，据我们多方实验不如硅胶板层析好。聚酸胺薄层析[113可以把RNA碱基A, G, C, U分开(G在原点)，但未报道DNA碱基中的T层析数据。桧山千都子等[[z]的硅胶薄层层析分离的碱基种类也很少。本实验根据前人的经验，摸索出的硅胶薄层层析法，只经单向展层就彻底分开了A, G, C, T, U 5种碱基混合物，各斑点很明晰，效果稳定，重现性很好，既可用于DNA及RNA碱基分离，又可用于此两种核酸混合物的各碱基测定。在薄层板的两端可各作一次分析，省时省原料。

(二)定量分析

1.标准曲线如图2示。回归方程的‘检验：查t表，df=n-2=3, t 0.01=5.841，而现在A的t=33.43, G为17.96, C为17.39,T为9.26，均>10.01，故P<0.01，差异极为显著。这表明5-25nM范围内线性关系好，宜作定量分析，灵敏度也高，可测小于l,ug的碱基。由于有明显的线性关系，所以在此范围内如果样品和标品积分值接近，可由样品nM二样品积分值X15/标品积分值，直接算出样品碱基含量，省去作标准曲线，使工作更为简便。

2.分析结果如表2示。由表2数据可看出，(G+C)克分子外最大标准误差在1 0.66以下，相对误差土1.28%以下，各碱基的最大标准误差在1 0.50以下，相对误差4.42务以下，符合一般光学分析法的误差范围。另外，将本实验测得的小牛胸腺DNA(G+C)克分子%，44.02多，与文献[[31报道的不同作者的常法分析结果为41.60-44.80并相比，也说明本法结果可靠。

本报告摸索出的核酸碱基硅胶薄层层析双波长色谱扫描分析，只需1.5小时的单向层离就可把A, G, C, T, U彻底分开，扫描测定半小时即可完成，可测低至5nM (即1ug 以下)的碱基，经统计处理完全符合一般光学分析法的准确度(相对误差士5多);溶剂系统简单，主要用国产硅胶，故价廉。所以，在核酸碱基分析方面，与现在常用的纸层析和薄层层析洗脱比色法比较，本法简便、快速、灵敏、可靠。