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核酸碱基薄层层析及双波色谱扫描分析准确度验证

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薄层层析(TLC)技术

核酸组成成分及衍生物的分析除常用的电泳、纸层析和薄层层析 洗脱比色法外,近年来又出现了双波长色谱扫描法和高压液相层析法。但已报道的双波长色谱扫描法测定的碱基种类不多,在测定DNA (G + C)克分子外方面,尚未见报道。我们在实验中摸索出分离核酸碱基效果好的硅胶薄层析,并考查了双波长色谱扫描分析法的准确度。

材料和方法

(一)主要试剂及仪器

1.试剂碱基A, G, C, T 和U,均为层析纯,含量>98多;A, U德国产,C为BDH产,G, T分别为上海东海制药厂和恒信化工厂产。小牛胸腺DNA为上海牛奶公司产。薄层层析 用硅胶H,为青岛海洋化工厂产。薄层层

析用纤维素(Cell ulo sepulverM N300UV254),德国产。狡甲基纤维素钠为上海化学试剂厂产。

其他试剂为AR,水为重蒸水。

2.仪器日本岛律CS-910双波长色谱扫描仪。

(二)分析方法

1.薄层层析 分离(1)制板: 取16.28硅胶H, 1.8 g MN30OUV 254纤维素,0.5外挟甲基纤维素钠(离心去除悬浮物)90ml,于匀浆器中匀浆5分钟,速度以浆液不溅出为度,抽气,均匀涂布在6块20× l 0 cm或4块20×1 5cm的平整清洁的玻板上。

(2)薄层分离:称取25X103nM (1nM二10-9 M)A ,G ,C ,T ,U ,盛于不同容器中,再分别称取同样量的上述各碱基混合于一个容器,各加Im l水,1滴12N NaOH 液助溶,后加1滴浓HCl,用0.1 N HCI稀释到5m1。将上述硅胶薄层板于105℃活化半小时,按常法把单个及混合的碱基溶液分别点在不同的点上,用饱和正丁醇上行展开至前沿12cm 处取出,时间1.5小时。层析后风千或吹干,于254nm紫外灯上定位,画出各碱基斑点的位置,计算

Rf值。

2. DNA 碱基定量分析

(1)标准曲线绘制:准确称取并按上法配成各种碱基浓度为5nM/μl的A, G, C, T标准碱基混合液,取活化的3块20× 10cm硅胶板,每板点5点,分别为1,2,3,4,5冈,按前层析,用CS-910双波长色谱扫描仪测定。测定条件:λS=265nm, λR=370nm,反射法,线性扫描。用量高法计积分值,将各板中种类和含量均相同的碱基之积分值加和平均,求各碱基积分值和nM 之间关系的回归方程,作出以积分值(任意单位)为Y, nM 为X的回归直线,即为标准曲线。

(2)样品测定:加2 mg DNA样品和2m188多甲酸于GG 17玻璃制的2m1安瓶中,按Aaron Bendicht4,法水解,依标准碱基溶液配法溶成0.2m1样品液。取不同量的样品液与3μl标准碱基混合液点于同板的不同点上,层析和扫描测定后,选取积分值与标品积分值相差不大的样品量作为测定点样量。取3块薄层板,每板点标品3μl,共3点,样品按预测量点样,亦为3点,照前层析和扫描,分别求出各板中标品和样品相应碱基积分值的平均值,在相应碱基标准曲线上找出标品积分值和15nM 所在的点,从该点推出标准曲线的平行线,即校正曲线,其上由样品积分值对应的X值就是样品的nM数。如果样品和标品积分值接近,也可由样品rim二样品积分值X15"标品积分值,直接算出来。

<center> <img alt="核酸碱基薄层层析及双波色谱扫描分析准确度验证" height="120" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/08/27/A1377591033.gif" width="352" /></center>

就得到分析结果。把3块薄层板测得的上述数值平均,便是该DNA的碱基组成。

<center> <img alt="核酸碱基薄层层析及双波色谱扫描分析准确度验证" height="554" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/08/27/A1377591032.jpg" width="389" /></center>

结果和讨论

(一)碱甚菠层层析结果

如表1和图1示。对于核酸碱基薄层层析 分离,大多数文献是使用纤维素板,据我们多方实验不如硅胶板层析好。聚酸胺薄层析[113可以把RNA碱基A, G, C, U分开(G在原点),但未报道DNA碱基中的T层析数据。桧山千都子等[[z]的硅胶薄层层析分离的碱基种类也很少。本实验根据前人的经验,摸索出的硅胶薄层层析法,只经单向展层就彻底分开了A, G, C, T, U 5种碱基混合物,各斑点很明晰,效果稳定,重现性很好,既可用于DNA及RNA碱基分离,又可用于此两种核酸混合物的各碱基测定。在薄层板的两端可各作一次分析,省时省原料。

(二)定量分析

1.标准曲线如图2示。回归方程的‘检验:查t表,df=n-2=3, t 0.01=5.841,而现在A的t=33.43, G为17.96, C为17.39,T为9.26,均>10.01,故P<0.01,差异极为显著。这表明5-25nM范围内线性关系好,宜作定量分析,灵敏度也高,可测小于l,ug的碱基。由于有明显的线性关系,所以在此范围内如果样品和标品积分值接近,可由样品nM二样品积分值X15/标品积分值,直接算出样品碱基含量,省去作标准曲线,使工作更为简便。

2.分析结果如表2示。由表2数据可看出,(G+C)克分子外最大标准误差在1 0.66以下,相对误差土1.28%以下,各碱基的最大标准误差在1 0.50以下,相对误差4.42务以下,符合一般光学分析法的误差范围。另外,将本实验测得的小牛胸腺DNA(G+C)克分子%,44.02多,与文献[[31报道的不同作者的常法分析结果为41.60-44.80并相比,也说明本法结果可靠。

<center> <img alt="核酸碱基薄层层析及双波色谱扫描分析准确度验证" height="535" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/08/27/A1377591028.jpg" width="303" /><br /> </center> <center> <img alt="核酸碱基薄层层析及双波色谱扫描分析准确度验证" height="216" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/08/27/A1377591030.jpg" width="467" /></center>

本报告摸索出的核酸碱基硅胶薄层层析双波长色谱扫描分析,只需1.5小时的单向层离就可把A, G, C, T, U彻底分开,扫描测定半小时即可完成,可测低至5nM (即1ug 以下)的碱基,经统计处理完全符合一般光学分析法的准确度(相对误差士5多);溶剂系统简单,主要用国产硅胶,故价廉。所以,在核酸碱基分析方面,与现在常用的纸层析和薄层层析洗脱比色法比较,本法简便、快速、灵敏、可靠。

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