SPA菌协同凝集试验
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基本原理
由于SPA能与IgG的Fc片段非特异性结合,同时不影响Fab片段的活性,所以当带有SPA的金黄色葡萄球菌与抗体混合,再加入适量的相应抗原 ,结果会使出现的凝集反应更易于观察。它对颗粒性抗原和可溶性抗原抗体反应都有协同凝集作用。此方法简便、快速、便于推广应用。
材料与试剂
1.金黄色葡萄球菌
(1) SPA阳性株:NO.1800株(国内分离株)比Cowan株(国际标准株)更为优越,在加热过程中,不易出现自家凝集,更适用于协同凝集实验。
(2) SPA阴性株:Wood 46株。
2.试用菌种 炭疽杆菌、枯草杆菌及蜡样芽胞杆菌。
3.炭疽免疫 血清。
4.正常免疫血清。
5.培养基。
6.0.01Mol/L pH 7.4 PBS 液,0.1%NaN3的0.01Mol/L pH7.4 PBS液,
0.5%福尔马林的0.01Mol/L pH 7.4 PBS液。
7.生理盐水。
8.磁力搅拌器等。
操作方法
1.将N0.1800株接种琼脂斜面培养基上,37℃培养20h~24h。
2.以少量生理盐水洗下菌体,4 000r/min离心20min。
3.将沉淀的菌体用0.01mol/L pH7.4 PBS液洗3次,然后用含0.5%福尔马林的0.01mol/L pH 7.4PBS液制成10%(V/V)悬液,置室温下3h。
4.将悬液56℃水浴30min,离心,用PBS液洗2次。最后用含0.1%NaN3的PBS液制成10%悬液,即为SPA菌稳定液,置4℃冰箱备用。
5.将SPA悬液1ml(如从冰箱拿出,可再用PBS液洗一次),加灭活的炭疽阳性血清0.1ml,37℃30min。
6.4 000r/min离心20min,去上清,沉淀用PBS液洗2次,最后用含0.1%NaN3的PBS液制成10%悬液,共10ml,此即为SPA菌的凝集用试剂。
7.取干净载玻片,用接种环取1滴已标记的SPA凝集用试剂,然后再从琼脂斜面上取少量待试细菌,充分混合,2min内纪录结果。
8.对照组的设置
(1) SPA阴性菌标记免疫血清对照。
(2) SPA阳性菌标记正常血清对照。
(3) SPA稳定液与炭疽杆菌凝集对照。
(4) 抗炭疽血清与炭疽菌凝集对照。
(5) 其它芽胞杆菌凝集试验对照。
结果判定
强度以“+~++++”表示:
++++: 2min内,菌体凝集成大颗粒,液体透明。
+++ : 2min内,菌体凝集成较大颗粒,液体透明。
++ : 2min内,菌体凝集成较小颗粒,液体轻度透明。
+ : 2min菌体部分凝集成细小颗粒,液体混浊。
- :2min内,无凝集现象,或2min以上才能出现细小颗粒者。