精子穿透实验SPA

异种体外受精是将不同种动物的雌雄配子模拟体内条件混合培养使其融合受精的一项生高技术。通常采用金黄地鼠卵为雌配子与各种哺乳动物或人的精子进行实验,因此又称精子穿透试验 (SPA)。人精子与地鼠卵体外受精结果与人同种体外授精呈高度正相关关系，可取代人卵用来检测人精子的受精能力。SPA可反映精子获能、顶体反应和精卵相互作用诸多方面的功能，因此可用于以上方面的生理学、药理学和毒理学角度的研究。

1 实验准备与操作标准

实验全程按细胞培养标准进行准备与操作业，涉及卵子的步骤在体视显徽镜监控下进行。

2 动 物

8-12周龄金黄地鼠；纯系鼠料饲养，每日补充鲜胡萝b 20-30g/只；自然光照，光/暗时间比约为14/10h；室温16-30℃。选用8-20周龄鼠用于超排卵实验。

3 培养液配制

采用通用的Bww培养液。配制程序参照MarLinE稍加改良。试剂均为国产分析纯，三蒸水或蒸馏去离子水配制 。贮备液配方见表1，于800ml水中侬次溶入1-4；用 50ml水单独溶解 5后加入，再依次溶入6-12。此时溶液呈红色pH约 7.8。4℃贮存 。2月内使用 。

工作液 （BWW ）配制程序：l00ml 贮备液中依次溶入碳酸氢钠210mg，葡萄糖 l00mg，乳酸钠糖浆（70-80 ）0.325ml，人血清白蛋白350mg。用 1.0mol/LHEPES或碳酸氢钠调 pH 8.0土0.1；0.45μm和0.22μm微孔滤膜先后过滤；分装密 封，4℃贮存，1周内使用 。

4 地鼠超排卵与卵子制备

选动情周期第1天 （见阴道乳白色分泌物）雌 鼠，上午8——9时腹腔注射孕马血清促性腺激素（PMSG ）30—— 40IU/只；56——61 h后注射人绒膜激素（hCG）等量；17h后断头解剖，取出输卵管放入预 冷 （4℃）BWW 中，针刺腹壶部取卵并洗净；0.1 %透明质酸酶消散颗粒细胞：洗净卵子 ；0.05% 胰酶消化透明带并洗净。制得卵子立即用于授精或放在甲基硅油复盖的Bww 中，4℃存 放4h内使用 。在1次实验 中将 23只条件相似的地鼠分为2组 ，分别于注 射 PMSG 56和 61h后注射 hCG，取卵后计数每只排卵数 ，比较两组排卵效果 。

5 精液处理与精子获能

人 ：正常生育力青年男子按摩采集精液。液化精液用双层撩镜纸过滤；取 0.4ml精液注入 2mlBWW（于 5ml试管 ）底 部 ，37℃斜置培养1h；竖起 5 min，吸出80 %上层液即得活精子悬液 。离心洗涤2遍并调整精子浓度为 l×l06/ml左右 。将此悬液lml置于1.5 ml塑料离心管巾密封培养 （37℃，5h）以使精子获能。

小 鼠：8-12周龄ICR小鼠，断头 剖 出附睾 ，剔净周围组织，剪下附睾尾放入0.2ml Bww中剪碎 ；37℃培养 5 min使精子游出；吸取精子悬液稀释至 （1-2）×l0ml，培养3h。

6 授精

去透明带地鼠卵经 37℃预培养 5min；吸取10-20颗卵子置塑料培养皿 （15mm×30mm，）中成球形小滴 ，注入获能精子50μL，滴上灭菌甲基硅油覆盖液面 ，于37℃ ，饱和湿度中培养 2-3h。

7 检查

授精后卵子 Bww 洗涤3遍除去贴 附精子 ；将卵子放于4角滴有特制软蜡 （凡士林 ；石蜡 一9：l，V：V）的载片中央 ，加上盏玻片（2.1mm×2.1mm）。轻压4角使卵子压扁 ；相差显微镜观察 。 卵内有膨大透亮精子头或 2个以上原核井伴精子尾判断为受精；受精率 （FR）=受精卵数/检查卵数× 100 。

8 重复实验与质量控制

按以上程序进行了多次重复实验。人精子16例次，小鼠精子8例次 。实验质量控制采用同一精液标本在同一次实验中分成7个平行样，不同操作者平行操作，量后分别计算FR，求出均 数及 其变异系数 （CV），以 CV≤l5 为合格]。

SPA实验步骤烦多，操作要求很高。其中至为关键的步骤如下：

（1）所有器皿均应按细胞培养要求进行严格的清洗与灭菌处理;

（2）卵子采集和处理过程须特别精确和迅速。为避免卵子活性降低，可在取下输卵管后和酶作用前的几个步骤中将其置于冰冷（4 ℃ ）。BWW中进行;

（3）用胰酶消化时要完全在体视显微镜监控下操作，待透明带变薄而松驰、欲失未失时即移出清洗， 以免胰酶损伤卵子；

（4） 精子获能时温度应控制好（37℃），精子密度应调节在合适水平 （人：10 X10⁶/ml , 小 鼠：1X10⁶/ml ），否则影响受精率；

（5）检查受精卵时载片四角蜡滴大小要均匀，软硬度要随室温调整合适，压片时各角受力要一致，以免卵子过分变形或崩破而影响观察。