溶血空斑试验技术(Hemolytic antibody plaques formation test technique
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溶血空斑试验是体外检测单个抗体形成细胞(B淋巴细胞)的一种方法,即将经绵羊红细胞(SRBC)免疫 过的家兔淋巴结或小鼠脾脏制成细胞悬液,与一定量的SRBC结合,于37℃作用下,免疫活性淋巴细胞能释放出溶血素,在补体的参与下,使抗体形成细胞周围的SRBC溶解,从而在每一个抗体形成细胞周围,形成肉眼可见的溶血空斑。每个空斑表示一个抗体形成细胞,空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。由于溶血空斑试验具有特异性高,筛选力强,可直接观察等优点,故可用做判定免疫功能的指标,观察免疫应答的动力学变化,并可进行抗体种类及亚类的研究。
目前有关溶血空斑试验的具体方法很多,现仅将琼脂 平板溶血空斑试验的操作方法简介如下。
二﹑材料与试剂
(一) 材料
平皿(直径5.5cm ×1.5cm),温箱(37℃),水浴箱(45℃),离心机 ,显微镜及白细胞计数器,18g~25g昆明系小鼠等。
(二)试剂
1.SRBC悬液 取无菌脱纤绵羊血(或阿氏液保存的血液),用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗3次,每次2 000r/min离心5min,最后取压积红细胞,悬于灭菌pH值7.2 PBS(含Ca2+、Mg2+)中,使成为20%浓度,经细胞计数后,调整细胞浓度为2.00×109个 /ml。
2. 0.1Mol/ L pH值7.2PBS(含Ca2+、Mg2+).
3.低层和顶层琼脂 将抗补体作用小的琼脂(日本琼脂粉或旅大水产制品厂的产品)用PBS配成1.4%和0.7%两种浓度。将0.7%的琼脂分装小试管,每管1.5ml备用。
4.DEAE-右旋糖酐 分子量5万,用蒸馏水配成1%浓度备用。
5.补体 采集3只以上豚鼠血清,应用时用PBS稀释成1︰30浓度(如不加DEAE-右旋糖酐,可采用原补体或做1︰5稀释)。
三﹑操作方法
(一)免疫脾细胞悬液的制备
1.小鼠免疫 每只小鼠经尾静脉或腹腔注入上述SRBC悬液0.2ml。
2.脾细胞悬液的制备 将免疫后第四天的小鼠拉颈处死,解剖取出脾脏,放入含含Ca2+、Mg2+冷的pH7.2的PBS中漂洗后,去掉结缔组织,加入适量的PBS,用弯头镊子挤压脾细胞,稍静置,吸上清液至离心管中,1 500r/min离心5min,弃上清后,定量加入PBS,混匀,按白细胞计数法计算脾细胞数,最后用PBS调整细胞数至1.00×107 个/ml,一般每只鼠脾脏细胞数为1×108~1.5×108。
(二) 倾注底层琼脂
将1.4%琼脂凝胶加热融化后,倾注于水平位置的平皿内,每皿2ml~3ml,凝固后,置37℃温箱,平皿反扣,开盖1h后备用。
(三) 顶层琼脂的制备
将0.7%的琼脂融化后,置于45℃恒温水浴箱中,依次加入以下试剂:
⑴ 2.00×109/mlSRBC悬液0.1ml。
⑵ 1%DEAE-右旋糖酐0.05ml。
⑶ 1.00×107/ml脾细胞悬液0.1ml。迅速混匀后,倾注于已铺好底层琼脂的
平皿内,使之均匀铺平凝固后,静置约15min,放37℃温育1h~1.5h。
(四) 加补体
从温箱中取出平皿,每皿加入1︰30稀释的新鲜豚鼠血清1.5ml(如未加DEAE-右旋糖酐,则加原血清或1︰5稀释的新鲜血清1.5ml),继续放37℃温箱中温育30min后取出,观察溶血空斑。也可在室温下放置1h,4℃冰箱过夜,翌日观察结果。如需保存,可加入用生理盐水或PBS配制的0.25%戊二醛6ml进行固定。
四、结果判定
观察时,将平皿对着光亮处,用肉眼或放大镜观察每个溶血空斑的溶血状况,并记录整个平皿中的空斑数,同时求出每百万个脾细胞内含空斑形成细胞的平均数。
五、注意事项
⒈ 对SRBC的要求 因为SRBC既是免疫原,也是靶细胞和指示细胞,故要求SRBC应新鲜,洗涤不超过3次,每次2 000r/min离心5min,细胞变形或脆性增大者均不能使用。阿氏液保存的血液可用两周。
2.免疫所用SRBC的数量 尾静脉注射以2.00×104 个/0.2ml为宜。腹腔注射为4.00×108 个 /ml,用量小,如低于1.00×107个/ml注射0.5ml,空斑形成极少;用量过大,超过2.50×109个/ml,多不能形成空斑。
3.采取免疫脾的时间 无论是经尾静脉还是腹腔免疫,均以免疫后第四天取脾为宜,过早或过晚空斑都形成极少。
4.脾细胞的活力 为了保证脾细胞的活力,制备脾细胞过程中所用PBS(或Hank’s液),最好临用时方从4℃冰箱中取出,或整个操作过程应在冰浴中进行。
5.倾注平板的要求 底层要平,上层要把握好温度。
6.补体的活力 补体活力的大小,对溶血空斑的形成关系很大。如出现抗体或补体的活力低下,将不能形成空斑。所以补体要新鲜,并宜将3只以上豚鼠血清混合。试验中加入Ca2+、Mg2+是为了活化补体。DEAE-右旋糖酐是一种多盐的水溶性物质,由于琼脂的半乳糖链上含有抗补体的硫酸酯基团,DEAE-右旋糖酐能与它形成不可置换的结合,而使之沉淀,从而消除琼脂的抗补体作用。
7.空斑计数 要求判读准确,避免辨认造成的误差。遇可疑空斑时,应镜检,对肉眼结果进行核对。