溶血空斑实验技术（Hemolytic antibody plaques formation test technique）

一﹑原理

溶血空斑实验是体外检测单个抗体形成细胞（B淋巴细胞）的一种方法，即将经绵羊红细胞（SRBC）免疫过的家兔淋巴结或小鼠脾脏制成细胞悬液，与一定量的SRBC结合，于37℃作用下，免疫活性淋巴细胞能释放出溶血素，在补体的参与下，使抗体形成细胞周围的SRBC溶解，从而在每一个抗体形成细胞周围，形成肉眼可见的溶血空斑。每个空斑表示一个抗体形成细胞，空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。由于溶血空斑实验具有特异性高，筛选力强，可直接观察等优点，故可用做判定免疫功能的指标，观察免疫应答的动力学变化，并可进行抗体种类及亚类的研究。

目前有关溶血空斑实验的具体方法很多，现仅将琼脂平板溶血空斑实验的操作方法简介如下。

二﹑材料与试剂

1、材料

平皿（直径5.5cm ×1.5cm），温箱（37℃），水浴箱（45℃），离心机，显微镜及白细胞计数器，18g～25g昆明系小鼠等。

2、试剂

（1）SRBC悬液 取无菌脱纤绵羊血（或阿氏液保存的血液），用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗3次，每次2000r/min离心5min，最后取压积红细胞，悬于灭菌pH值7.2PBS（含Ca2+、Mg2+）中，使成为20%浓度，经细胞计数后，调整细胞浓度为2.00×109个/ml；

（2）0.1Mol/L pH值7.2PBS（含Ca2+、Mg2+）；

（3）低层和顶层琼脂 将抗补体作用小的琼脂（日本琼脂粉或旅大水产制品厂的产品）用PBS配成1.4%和0.7%两种浓度。将0.7%的琼脂分装小试管，每管1.5ml备用；

（4）DEAE-右旋糖酐 分子量5万，用蒸馏水配成1%浓度备用；

（5）补体 采集3只以上豚鼠血清，应用时用PBS稀释成1:30浓度（如不加DEAE-右旋糖酐，可采用原补体或做1:5稀释）。

三﹑操作方法

1、免疫脾细胞悬液的制备

（1）小鼠免疫 每只小鼠经尾静脉或腹腔注入上述SRBC悬液0.2ml；

（2）脾细胞悬液的制备 将免疫后第四天的小鼠拉颈处死，解剖取出脾脏，放入含含Ca2+、Mg2+冷的pH7.2的PBS中漂洗后，去掉结缔组织，加入适量的PBS，用弯头镊子挤压脾细胞，稍静置，吸上清液至离心管中，1500r/min离心5min，弃上清后，定量加入PBS，混匀，按白细胞计数法计算脾细胞数，最后用PBS调整细胞数至1.00×107个/ml，一般每只鼠脾脏细胞数为1×108～1.5×108。

2、倾注底层琼脂

将1.4%琼脂凝胶加热融化后，倾注于水平位置的平皿内，每皿2ml～3ml，凝固后，置37℃温箱，平皿反扣，开盖1h后备用。

3、顶层琼脂的制备

将0.7%的琼脂融化后，置于45℃恒温水浴箱中，依次加入以下试剂：

（1）2.00×109/mlSRBC悬液0.1ml；

（2）1%DEAE-右旋糖酐0.05ml；

（3）1.00×107/ml脾细胞悬液0.1ml。

迅速混匀后，倾注于已铺好底层琼脂的平皿内，使之均匀铺平凝固后，静置约15min，放37℃温育1h～1.5h。

4、加补体

从温箱中取出平皿，每皿加入1:30稀释的新鲜豚鼠血清1.5ml（如未加DEAE-右旋糖酐，则加原血清或1:5稀释的新鲜血清1.5ml），继续放37℃温箱中温育30min后取出，观察溶血空斑。也可在室温下放置1h，4℃冰箱过夜，翌日观察结果。如需保存，可加入用生理盐水或PBS配制的0.25%戊二醛6ml进行固定。

四、结果判定

观察时，将平皿对着光亮处，用肉眼或放大镜观察每个溶血空斑的溶血状况，并记录整个平皿中的空斑数，同时求出每百万个脾细胞内含空斑形成细胞的平均数。

五、注意事项

1、对SRBC的要求 因为SRBC既是免疫原，也是靶细胞和指示细胞，故要求SRBC应新鲜，洗涤不超过3次，每次2000r/min离心5min，细胞变形或脆性增大者均不能使用。阿氏液保存的血液可用两周。

2、免疫所用SRBC的数量 尾静脉注射以2.00×104个/0.2ml为宜。腹腔注射为4.00×108个/ml，用量小，如低于1.00×107个/ml注射0.5ml，空斑形成极少；用量过大，超过2.50×109个/ml，多不能形成空斑。

3、采取免疫脾的时间 无论是经尾静脉还是腹腔免疫，均以免疫后第四天取脾为宜，过早或过晚空斑都形成极少。

4、脾细胞的活力 为了保证脾细胞的活力，制备脾细胞过程中所用PBS（或Hank’s液），最好临用时方从4℃冰箱中取出，或整个操作过程应在冰浴中进行。

5、倾注平板的要求 底层要平，上层要把握好温度。

6、补体的活力 补体活力的大小，对溶血空斑的形成关系很大。如出现抗体或补体的活力低下，将不能形成空斑。所以补体要新鲜，并宜将3只以上豚鼠血清混合。试验中加入Ca2+、Mg2+是为了活化补体。DEAE-右旋糖酐是一种多盐的水溶性物质，由于琼脂的半乳糖链上含有抗补体的硫酸酯基团，DEAE-右旋糖酐能与它形成不可置换的结合，而使之沉淀，从而消除琼脂的抗补体作用。

7、空斑计数 要求判读准确，避免辨认造成的误差。遇可疑空斑时，应镜检，对肉眼结果进行核对。