在ELISA实验技术中的抗原抗体反应

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抗原实验技术及研究进展

抗体

1. 抗体的结构

抗体是能与抗原 特异性结合的免疫球蛋白 (immunoglobulin,Ig)。Ig 分五类，即IgG、IgA 、IgM、IgD 和IgE。与免疫测定有关的Ig 主要为 IgG 和IgM。Ig 由两个轻链(L)和两个重链(H)的单体组成。Ig 的轻链是相同的，有κ(kappa)和λ(Lambda )两种型别。五类Ig 的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。IgG 和IgM 的重链分别称为γ(gamma )链和μ(mu )链。重链和轻链的 N 端的氨基酸排列顺序因各种抗体而异，称为可变区，分别用VH 和VL 表示。两者构成抗体的抗原结合部位，只与相应的抗原决定簇匹配，发生特异性结合，是抗体专一性结合抗原的结构基础。

IgG 可被木瓜蛋白酶分解为三个区段，其中两个相同的区段称抗原结合片段(Fab )。每个Fab 都保存结合抗原的能力，但只有一个抗原结合位点，是单价的，与抗原结合后不出现凝集或沉淀。另一区段称Fc 段，无抗体活性，但具有IgG 特有的抗原性。

IgG 可被胃蛋白酶分解为两个片段，一个Fab 双体，称F(ab’)2，能和两个相同的抗原结合;另一片段类似Fc，随后被分解成小分子 多肽，无生物活性。

IgM 是由五个单体组成的五聚体，含 10 个重链和10 个轻链，具有10 个抗原结合价，由于空间位置的影响，只表现为五个抗原结合价。IgM 分子 量约为900000， IgG 分子量约为150000 。

机体被微生物感染后，先产生 IgM 抗体，然后产生IgG 抗体。经过一段时间，IgM 抗体量逐渐减少而消失，而IgG 抗体可长期存在，在疾病痊愈后可持续数年之久。IgM 抗体一般为保护性抗体具有免疫性。因此IgM 抗体的测定，对某些传染病如甲型肝炎有较高的临床诊断价值。右图为为甲型肝炎病人血清中IgG 抗体和IgM 抗体出现的时间和水平。

2. 抗原抗体反应

2.1 可逆性

Ag·Ab 的解离程度与K 值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性，因此可用亲和层析法来提纯抗原或抗体。在抗血清中，特异性的IgG 抗体仅占总IgG 中的极小部分。用亲和层析法提取的特异性抗体，称为亲和层析纯抗体，应用于免疫测定中可得到更好的效果。

2.2 最适比例

在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物(沉淀)的量见图1-4。曲线的高峰部分是抗原抗体比例最合适的范围，称为等价带(zone of equivalence )。在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带。

如果抗原或抗体极度过剩，则无沉淀物形成，在免疫测定中称为带现象(zone phenomenon )。抗体过量称为前带(prezone)，抗原地过量称为后带(postzone)。在用免疫学方法测定抗原时，应使反应系统中有足够的抗体量，否则测得的量会小于实际含量，甚至出现假阴性。

2.3 特异性

抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。例如乙肝病毒中的表面抗原( HBsAg )、e 抗原(HBeAg)和核心抗体(HBcAg)，随来源于同一病毒，但仅与其相应的抗体结合，而不与另外两种抗体反应。抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物(例如血清)中测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。

但是这种特异性也不是绝对的。假使两种化合物有着部分相同的结构，在抗原抗体反应中可出现交叉反应。例如：绒毛膜促性腺激素( hCG)和黄体生成激素(LH)均由α和β两个亚单位组成，其结构的不同处在β亚单位，而两者的α亚单位是同类的。用hCG 免疫动物所得的抗血清中含有抗α-hCG 和抗β-hCG 两种抗体，抗α-hCG 抗体将与LH 中的α酶位发生交叉反应。在临床检验中，如用抗hCG 抗血清作为妊娠诊断试剂检定尿液中hCG，只能用于hCG 浓度较高的试验，否则妇女生理性排泄入尿液中的微量LH 将与之发生交叉反应。因此在作为早孕诊断(敏感度应达到50mIu/mlhCG )的实际中必须应用只对hCG 特异的抗β-hCG，以避免与其它激素的交叉反应的发生。

2.4 敏感性

在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为 mg/ml 水平，酶反应测定法的敏感度约为5~10μg/ml，免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿。标记的免疫测定的敏感度可提高数千倍，达ng/ml 水平。例如，用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定HBsAg，其敏感度可达0.1ng /ml。

3. 免疫测定在临床检验中的应用

由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广，在临床检验中可用于测定：

1) 体液中的各种蛋白质，包括含量极少的蛋白质如甲胎蛋白等。

2) 激素，包括小分子量的甾体激素等。

3) 抗生素和药物。

4) 病原体抗原，HBsAg、HBeAg 等。

5) 另外，也可利用纯化的抗原检测标本中的抗体，例如抗-HBs 等。

4.标记的免疫测定

如上所述，免疫测定是一种很敏感的测定方法，抗原抗体反应后直接测定形成的沉淀或浊度，敏感度可达 5~10μg/ml，但在临床检验中，某些待测物在标本中的含量远低于这一水平，因此要寻找增加敏感度的方法。标记的免疫测定是将检测试剂中的抗原或抗体用可微量测定的物质加以标记，通过测定标记物来提高敏感度。在放射免疫测定和酶免疫测定中，标记物分别为放射性核素和酶，最后用测定放射性和酶活力来计算待检物的量，敏感度可比直接测定沉淀物提高数百至数千倍。在标记免疫测定中，一般加入过量的标记试剂以保证与待测物彻底反应。以标记抗体(Ab ※)检测抗原(Ag)为例，反应式如下：

Ag+ Ab※→ AgAb※+ Ab※

在反应产物中有与Ag 结合的Ab※和游离和Ab※ ，如不将两者分离而测定标记物，测得的结果将为两者之和。因此，游离标记物与结合标记物的分离是标记免疫测定中的重要步骤。可采用多种手段，固相载体是其中之一。如将抗原或抗体包被在固相载体上，然后再与标记的抗原或抗体直接反应，结合的标记物被固定在载体上，而游离的标记物留于溶液中。这样可以通过洗涤将游离的Ab ※除去，结合标记物的测定可在固相上进行。

5.酶免疫测定

酶免疫测定(enzyme immunoassay )可分为均相(homogenous)和非均相(heterogenous )两种类型。

在均相EIA 中可不需进行游离的和结合的标记物的分离而直接测定标记物。例如在某种条件下，抗原抗体反应后形成的酶标记抗原抗体复合物中的酶失去其对底物作用的活力，因而测出的酶活力直接反映游离的酶标记物。均相EIA 在临床检验中较少应用。非均相EIA 需先进行游离的和结合的标记物的分离。如前所述，固相载体可用作一种分离手段。这种固相酶免疫测定方法在1971 年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay )，简称ELISA ，在国内有译作酶联免疫吸附试验的，虽然含义不完全确切，但已习用。