显微镜放射自显影样品的制备及观察

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显微放射自显影就是运用放射性标记化合物掺入生物样品，以及用核乳胶记录生物样品内放射性同位素释放核射线的技术。根据放射性标记化合物的性质和银粒的分布部位与数量可显示生物样品内生物大分子 合成的特异性、部位、相对数量及其动态变化。因此放射性自显影技术广泛应用于生物大分子新陈代谢的研究工作。

一、目的与要求
1、了解放射自显影的原理与用途。
2、初步掌握显微放射自显影样品的制备和方法
3、基本学会显微放射自显影样品的观察、记录与分析
4、验证细胞核 内DNA与RNA合成的标记

二、原理
同位素在机体内（或细胞）具有相同的代谢途径；掺入生物样品内放射性同位素释放的核射线产生电离作用，使乳胶中的一些银离子发生聚集而形成“影像”；显影后“影像”处的银离子还原呈银原子，定影期间，乳胶内未聚集的银离子被溶解至定影液中，因此生物样品内掺入放射性同位素的部位呈黑色颗粒，简称银粒。并且放射性标记化合物的掺入量、生物样品中核蜕变释放的射线量和银粒数三者之间成正比。

三、实验内容
1、3H－T标记组培细胞DNA的合成。
2、3H－U标记四膜虫RNA的合成。

四、实验步骤
（一）组培细胞DNA合成的显微放射自显影技术
1． 制备放射性3H－T标记的生物样品
（1）培养细胞：在每个洗净的青霉素瓶中放入一块长方形的盖玻片，加入1ml细胞悬液，置37°C培养细胞。
（2）标记：当盖玻片50－70％的表面长有细胞时，将实验组的盖玻片转入装有1ml含3H－胸腺嘧啶核苷（3H－T的剂量未1mCi/ml）培养液的青霉素小瓶内。对照组倒掉原培养液后，加入1ml不含3H－T的新培养液。将两组细胞置于37°C恒温箱内继续培养30分钟。
（3）洗涤：从青霉素小瓶中取出长有细胞的盖玻片，放在冷却的Hank液内洗涤5－8分钟（中间换Hank’s液2次），以洗去玻片及细胞表面吸附的 3H－T。
（4） 固定：将盖玻片放入Carnoy固定液中固定30分钟（中间换液1次）。
（5）洗涤：在95％、75％的酒精中洗2次，每次3分钟。然后将小玻片放在滤纸上干燥。
（6）贴片：在干净载玻片的中间偏右处滴上一、二滴中性树胶，将小玻片在无细胞的一面贴附在载片上，置37°C温箱干燥两天。
（7）编号：在载片近端处贴一小条胶布，根据实验分组，用铅笔在胶布上统一编号。
（8）涂保护膜：将两张载玻片无细胞的面紧贴在一起，将有细胞的载玻片一端浸入37°C预温的0.5％的明胶液中，缓慢取出，分开两张载片，竖放于切片盒中。或在小玻片旁滴明胶液，用玻璃推子涂保护膜，置37°C干燥。
上述放射性同位素实验操作步骤，应在指定的实验桌上具有放射性防护设施的托盘内进行。