电穿孔与电融合技术

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【实验目的】
1．了解细胞电穿孔和电融合的基本原理
2．学习电穿孔和电融合基本技术

【实验原理】
当细胞置于非常高的电场中，细胞膜 就变得具有通透性，能让外界的分子扩散进细胞内，这一现象称为电穿孔。运用这一技术，许多物质，包括DNA、RNA、蛋白质、药物、抗体和荧光探针都能载入细胞。作为一种基因转导方法，电穿孔已被广泛用于各种细胞类型，包括细菌、酵母、植物和动物细胞；而且，它还能作为注射方法（称为电注射），把各种外源物质引入活细胞。与其他常用的导入外源物质的方法相比，电穿孔具有很多优点。首先，不必象显微注射那样使用玻璃针，不需要技术培训和昂贵的设备，可以一次对成百万的细胞进行注射。第二，与用化学物质相比，电穿孔几乎没有生物或化学副作用。第三，因为电穿孔是一种物理方法，较少依赖细胞类型，因而应用广泛。实际上，对大多数细胞类型，用电穿孔法基因的转移效率比化学方法高得多。
除了能使细胞膜具有通透性，让外界的分子扩散入胞液中以外，高强度的电场脉冲也能引起细胞融合，这一现象叫做电融合。然而，在用电脉冲融合前必须使细胞相互紧密接触，这一电融合方法在原生质融合制取杂交植物，胚胎细胞相互融合制备动物克隆方面非常有用，尤其在制取杂交瘤细胞制备单克隆抗体方面用处很大。几个实验室已证明使用电场电融合效率比常规的化学融合方法高10到100倍，最近，贴壁细胞的电融合还被用来研究细胞融合时细胞的骨架成分和细胞器 的动力学重排。

【仪器、材料和试剂】
仪器：脉冲发生器；样品池（一个盛细胞的容器和两个平行的金属电极）；CO2培养箱，显微镜；离心机，微量移液器 ，镊子，剪刀，手术刀片，三角瓶，吸管，毛细管，离心管，载玻片，盖玻片，NALGEN一次性滤器。
材料：外源DNA，对数生长中期细胞
试剂：
穿孔介质（PM）：磷酸钾 15mmol/L
MgCl2 　1mmol/L
蔗糖（或甘露醇） 250mmol/L　
HEPES 10mmol/L　调节pH至7.3
融合介质（FM）：MgCl2 1mmol/L
甘露醇 280mmol/L
HEPES 　2mmol/L　调节pH至7.3

【方法与步骤】
悬浮细胞的电穿孔法：
1．电穿孔进行基因转移
电穿孔可用于将多种不同类型的分子载入活细胞中，操作步骤相似。本实验中，我们以基因转移为例。载入其他的分子时，只需把外源DNA换成所需分子即可。
1.1　使细胞在适宜的培养基中生长，用胰酶处理，收获对数生长中期的细胞，并用腺酶处理。
1.2　在穿孔介质（PM）中至少洗一次。洗细胞时，在台式离心机上1000rpm离心3分钟，使得悬浮细胞沉降。然后，去掉上清液，在新的介质中重新悬浮细胞。
1.3　计数细胞，在PM中，浓缩细胞为大约1千万细胞/ml。
1.4　将DNA加到细胞悬液中，充分混合，使DNA均匀分散，用吸管吸一定体积的细胞-DNA混合液到装有电极的灭菌小样品池中。