生长曲线测定（计数法）

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实验目的
1.能独立的进行细胞技术，会绘制生长曲线，了解细胞生长的发育特性。
2. 学习在科研中如何应用生长曲线。

实验原理
生长曲线的测定（计数法）是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，为培养细胞生物学特性的基本参数之一。一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。为了准确描述整个过程中的细胞数目的动态变化，需连续对细胞进行计数，通常计数7天。为精确起见，一般每次计数三瓶细胞并取平均值。典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，成平台状的平顶期及退化衰亡四个部分。以存活细胞数对培养时间做图，即生长曲线。
生长曲线常用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响。一般在对数期的1/3-1/2处加药。细胞技术的时间和次数依实验目的而定。
另外，测定生长曲线的常用方法还有mtt 法。

实验步骤
1. 胰酶消化细胞（一般用三种细胞，本实验用Hep2，Mel，CHO，本实验组用CHO），用新培养基中止，制成细胞悬液，吹打均匀，计数。
2.根据计数结果，每个方瓶中接细胞3×105个，加3mL培养基。一种细胞接15瓶。用作对照组4瓶，三个药物梯度（5、10、15ug/mL）各三瓶，2瓶备用。（本实验组因为细胞有限，故只接了7瓶，对照四瓶，10ug/mL三瓶）
3.24h后，计数1瓶细胞（相当于所有的瓶子的细胞都以这个数计算），分别加药。
4.48h、72h、96h后，分别计数，每个药物梯度和对照组各计一瓶。
5.计数是，用胰酶消化稍过一点。用原培养基中止消化。（这样做可以防止细胞损失）用27uL细胞和3uL台盼兰染色计数活细胞。要定容培养基的量（加入胰酶后的体积）第5步不用再超净台中完成。
6.以细胞数为纵轴，以时间为横轴作图。

实验结果 （图略）
我们可以看到，药物处理组明显不如对照组生长状况好，在第三天和第四天都不如对照组的细胞数量，实验组对数期曲线的斜率不如对照组。这说明该药物对细胞的增殖有一定抑制作用。
在对照组和实验组的两条曲线我们都可以看出，细胞在方瓶中的生长第一天都没有达到原来的3×105个，这说明有些细胞死亡，而存活的细胞因为贴壁、适应新环境，有一个潜伏期，所以第一天细胞数量有一定的减少。之后细胞生长进入对数期，我们看到在两种环境中的细胞都表现出了对数期的大量增殖。如果试验持续，我们还会看到平台期和衰亡期，但由于时间所限，我们只看到对数期。

实验分析
生长曲线是一个很重要的实验，在很多文献中均有提到。它可以帮助我们筛选药物，确定药物的活性，制定合理的后续实验方案以及了解细胞的生长能力。被处理过的细胞，还可以用于细胞形态特征（如Ho.33342染色观察凋亡小体）、生化特征（DNA、RNA提取 ，DNA ladder）以及细胞时相（流式细胞术观察细胞时相）等方面。实际上，我们的流式细胞术的实验就是用我们组自己处理的CHO细胞来完成的。生长曲线的测定方法还有MTT法，它是测定细胞琥珀酸脱氢酶的活性，然后用OD值来确定细胞的数量。
通常，生长曲线的实验要至少包括3种细胞，最好除了肿瘤细胞还要有正常细胞。（本实验用Hep2，Mel，CHO）为了准确描述整个过程中的细胞数目的动态变化，需连续对细胞进行计数，通常计数7天。为精确起见，一般每次计数三瓶细胞并取平均值。但是因为实验条件所限，所以我们的实验没有进行得那么完整。在以后自己真正的工作中，我们必须严格按照惯例来做。在选择细胞做生长曲线实验时，我们必须选取对数期的1/3-1/2的细胞，这是的细胞最有活力，对药物的反应也最敏感。事实上，大多数细胞学的实验都是用对数期的1/3-1/2的细胞。
要做好生长曲线（计数法）的实验，我们必须注意以下的要点。首先，要保证每一瓶中细胞的数量是一致的。这要求在我们接细胞时就必须准确，否则实验会有很大误差。其次，每天计数时，要将细胞完全从瓶壁上洗下。所以，在我们用胰酶消化时，可以稍微过头。取走细胞后，我们还可以用显微镜镜检方瓶。再次，细胞计数时要共计数2块计数板，即4个格子，以减少误差。事实上，我们发现两块计数板之间还是有很大误差的。计数时，每一个中格的细胞数最好在10-50之间，我们的实验组最高达到了70左右，这实际上对计数结果带来了一定的误差，应该将细胞适当稀释。最后，我们用台盼兰染色时间不可以过长。否侧或细胞会被台盼兰杀死，使得细胞膜 通透性丧失，也被染上色，这使得计数结果偏低。
实验数据最好经过统计的处理，这样更具有说服力，如进行相关性的检验。（可以使用SPSS软件）
计数法和MTT法的区别是计数法确定的是细胞的绝对数量，而MTT法实际上是检测细胞的代谢强度，当然，这与细胞的数量也是有一定的正比关系的。如果用MTT法，必须首先测出OD值与细胞数量的趋势线，在相关线性范围内，用MTT法测细胞数量。在需要知道确切数量时还使计数法更为准确、可靠。