电子显微镜的使用与细胞超微结构观察
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(1) 了解透射电子显微镜 的主要结构、功能与基本工作原理;
(2) 了解扫描电子显微镜的主要结构、性能与基本工作原理。
二、 实验步骤(讲解演示)
1)透射电镜样品超薄切片常规制作规程
1.取材:根据实验目的取材,要求部位准确,体积小于2mm3
2.醛类固定:用2%-3%的戊二醛固定2小时;
3.清洗:用磷酸缓冲液 清洗3次,每次10min;
4.锇酸固定:用1%-2%的锇酸固定2~3小时;
5.清洗:用磷酸缓冲液清洗3次,每次10 min;
6.脱水:用50%、70%、80%、90%乙醇梯度脱水各15min,再用100%乙醇脱水3次,每次30min;
7.置换:用环氧丙烷或丙酮置换3次,每次30min;
8.浸渍:10hr以上,浸渍过程如下:
①丙酮:包埋剂=3:1的浸渍液浸渍(动物样品1hr,植物 样品2~3hr);
②丙酮:包埋剂=1:1的浸渍液浸渍(动物样品1hr,植物样品2~3hr);
③丙酮:包埋剂=1:3的浸渍液浸渍(动物样品4hr,植物样品12~24hr);
④纯包埋剂浸渍(动物样品4hr,植物样品12~24hr);
9.包埋:将样品放入盛有纯包埋剂的包埋板中;
包埋剂配方中Epon812,MNA,DDSA,DMP-30的比例见附表
10. 聚合:将包埋板置于40C、60℃条件下各聚合48hr;
11.修块:将包埋头修成梯形,且样品表面积小于0.2mm×0.2mm
12.超薄切片:切片厚度50-90nm
13.染色:铀染色 5~15min 清洗
铅染色 5~10min 清洗
2)扫描电镜样品常规制备规程
1.取材:根据实验目的取材,要求部位准确
2.清洗:用磷酸缓冲液反复清洗样品表面的灰尘、杂质等附着物
3.固定:用2%-3%的戊二醛固定2小时
4.清洗:用磷酸缓冲液清洗3次,每次10 min
5.脱水:用50%、70%、80%、90%乙醇梯度脱水各15min,再用100%乙醇脱水3次,每次30min;
6.置换:用叔丁醇置换3次,每次30min
7.干燥:用冷冻干燥仪干燥样品
8.粘样:用双面胶带将样品粘到样品台上
9.镀膜:用离子溅射仪给样品镀10nm金膜