愈伤组织的诱导

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一、目的要求
学习诱导植物 器官外植体形成愈伤组织的方法。

二、基本原理
已有特定结构与功能的植物组织，在一定条件下，其细胞被诱导改变原来的发育途径，逐步逆转其原有的分化状态，转变为具有分生能力的胚性细胞，这个过程称为脱分化（dedifferentiation）。来自于植物各种器宫的外植体在离体培养条件下，细胞经脱分化等一系列过程，改变了它们原有的特性而转变形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团，即愈伤组织。一般情况下，植物各器官和组织均有诱导产生愈伤组织的潜在可能性。
植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的极为重要的因素。生长素是用于诱导愈伤组织形成的生长物质，常用的种类有2,4-D , IAA 和NAA , 所需浓度在0.01～10mg/L 范围内；常用的细胞分裂 素是激动素、玉米素和6-BA ，使用的浓度范围在0.1～10mg/L。对有些植物材料而言，生长素和细胞分裂素对保持愈伤组织的快速生长是必要的，特别是两者结合使用时，能更强烈地刺激愈伤组织的形成。来自于不同植物、同一植物的不同器官或组织，产生的愈伤组织在质地和物理性状方面是有差别的。
在一定条件下，离体的外植体可以形成愈伤组织（即一块未分化的组织），形成愈伤组织的过程也是细胞的脱分化过程。已有的实验表明，所有的多细胞植物，包括双子叶植物和单子叶植物，都有诱发愈伤组织形成的潜在可能性。一般认为诱发愈伤组织成败的关键不在于植物材料的来源，而在于培养的条件。外植体上损伤的细胞能释放一种自溶产物，对诱导细胞的分裂起着重要的作用。
但在培养基中还必须加人一些生长调节物质，才能使已经分化后静止的细胞恢复分裂、脱分化和生产愈伤织。但是在实践中，能否成功地诱导出愈伤组织还是研究者们面临的一个重要问题，有很多植物的愈伤组织的诱导还是不太成功。对有关植物细胞的生理、生长等研究工作来说，不能成功地诱导出该植物的愈伤组织就意味着实验的完全失败，后续植物细胞生理或代谢等的相关研究就根本无法开展。要使培养的细胞或组织最终发育成一个完整的植物体，一般要经过愈伤组织的细胞脱分化、人工诱导再分化两个不同的阶段，因此在这些实验中愈伤组织的诱导是否成功也是关键的基本因素。总之，愈伤组织诱导条件的选择在植物细胞培养 技术中占据着非常重要的地位。
影响愈伤组织诱导的因素包括以下几个方面:目前一般认为能够影响愈伤组织诱导形成的主要因素。（1）不同植物和外植体诱导愈伤组织能力的差异。(2）培养基种类对愈伤组织诱导的影响。（3）外源激素对愈伤组织诱导的影响。（4）培养条件对愈伤组织诱导的影响:湿度条件、温度条件、光照条件。

三、器材
1．材料：新鲜胡萝卜
2．培养基：(1) 准备好培养基各种母液。
(2) 诱导胡萝卜块根愈伤组织培养基为：MS +2,4-D 1mg/L＋蔗糖3g/L＋琼脂0.8g/L,
pH5.8。
3．器具：各种接种工具，超净工作台。

四、操作步骤
1．取新鲜胡萝卜的中间段，用洗涤剂和清水洗净，并用在70％酒精中浸泡过的纱布擦拭萝卜表面。
2．将萝卜浸入0.5％升汞中，消毒8～12min 。
3．用无菌水冲洗胡萝卜5 次，去除表面的升汞残留，并将胡萝卜置于无菌滤纸上，吸去表面水分。
4．用灭菌的打孔器钻取髓部或形成层部分。
5．将取下的部分置于无菌的培养皿中，切去两头各10mm , 余下部分切成厚3～6 的圆片，作为培养用外植体。
6．用镊子夹取外植体并置于培养基上，每瓶3～5 块为宜。并做好标记。
7．将培养材料置于28℃ 温箱或培养室中暗培养。
8．培养周期为4～6 周，培养过程中注意记录愈伤组织的生长情况和污染情况。