培养基的配制和灭菌

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以1000 ml “MS + 3.0 mg/l NAA + 0.5%（即5 g/l）琼脂 + 3%（即30 g/l）蔗糖”为例。

第一步：准备好配制培养基的一切用具和试剂。

第二步：称量5 g琼脂和30 g蔗糖，溶解在大约所要配制培养基 2/3~3/4左右体积（约600~750 ml）的（蒸馏）水中，加热溶解，不时搅拌，避免出现琼脂生块和泡沫。

第三步：根据用量，用量简或移液管从母液中取出所需量的大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素（每做1000 ml培养基，取20 ml大量成分、20 ml氯化钙母液、10 ml微量成分、10 ml铁盐母液和10 ml有机成分，以及3.0 mg NAA），放入预先有少量蒸馏水的烧杯中（以免加药液时溅出），然后加入琼脂和糖水溶液中搅拌混匀。

第四步：加水定容。待搅拌均匀后，用数滴稀碱（NaOH）将pH值调节到预定水平（一般为pH 5.8），当pH值偏碱时用稀酸（HCl）调节。用pH试纸或酸碱指示（或pH）计测定培养基的pH值。

第五步：将培养基用漏斗分装到培养容器中。每瓶加15~20 ml左右，之后加盖。

第六步：培养基进行灭菌。高压蒸气灭菌锅的温度为121℃，灭菌15~20分钟。

培养基常用高温高压（1.06 kg/cm2或0.1 MPa，121℃）蒸气灭菌的方法，灭菌时间应根据培养瓶体积大小及其内培养基容量多少而定（见表4）。体积和容量越大，所需灭菌时间就越长。空试管、空三角瓶和滤纸要在130℃下灭30分钟或121℃灭60分钟。空的培养容器不应同盛装培养基的培养容器一起高压蒸气灭菌，不同体积培养容器或盛装不同容量的培养基也不能一起高压蒸气灭菌，而应该分别进行。因为热穿透力是一个需要考虑的因素，体积大的培养容器需要较长的时间灭菌，是因为热量穿透大体积培养基要比体积小的花更多的时间。利用高压蒸气灭菌锅进行灭菌具有简单、快速，并且可以附带杀灭病毒又不吸收的优点（与过滤灭茵比较）。其缺点是会引起pH值的变化、发生化学变化和引起某些化合物的分解，使得某些培养基成分的活性丧失。高压蒸气灭菌会引起以下物质分解：蔗糖（分解为葡萄糖和果糖）、秋水仙素、玉米素（核甙）、赤霉酸（90%会丧失反应活性）维生素B1、B12、C和泛酸、抗生素、酶、植物 提取液（活性丧失）。所以，原生质体培养用培养基应采用过滤法灭菌。

表4 培养基或无菌水的最少灭菌时间
容器分装体积（mL） 121℃下最少灭菌时间（min）
20~60 15
75~150 20
250~500 25
1000以上 30以上

过滤灭菌可以除去溶液或液体培养基中直径大于过滤膜网孔直径的微粒、微生物 和病毒。与高压蒸气灭菌法相比，该法不会改变那些在高压蒸气灭菌中不稳定物质，但是也有些明显的缺点，如复杂而费时。通常采用0.22~0.45μm孔径的醋酸纤维素或硝酸纤维素膜筛。对培养基中的不稳定成分进行过滤灭菌时，首先对除不稳定成分以外的培养基进行高温高压灭菌，灭菌后放置于超净工作台中冷却，温度降到40~50℃时，在琼脂培养基尚未固化之前，在无菌条件下用注射器和无菌微孔滤膜（图1.7）将高温不稳定物质溶液打入培养基。