线粒体和液泡系的超活染色与观察

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活体染色是能使生活有机体的细胞或组织特异性着色但对活样品又没有毒害作用的一种活体染色方法，其目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。

根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活体染色与体外活体染色两类。体内活体染色是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是靠染料的“电化学”特性。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活体染色，理论上应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，且使用时需要配成稀淡的溶液。一般说来，最为适用的是碱性染料，这可能是因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B(Janus green B)和中性红(neutral red)两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体 和液泡系的染色分别具有专一性。

实 验 目 的

1. 观察动、植物 活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布;

2. 学习一些细胞器 的超活染色技术。

实 验 原 理

线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色;而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基(即无色状态)。

中性红为弱碱性染料，对液泡系(即高尔基体)的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。

实 验 用 品

一、器材

显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、解剖盘.载玻片、凹面载玻片、盖玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。

二、试剂

1. Ringer溶液：

氯化钠 0.85g (变温动物用0.65g)

氯化钾 0.25g

氯化钾 0.25g

氯化钙 0.03g

蒸馏水 100ml

2. 10%、1/3000中性红溶液：

称取0.5g中性红溶于50ml Ringer液，稍加热 (30~40℃)使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml，加入29ml Ringer溶液混匀，装入棕色瓶备用。

3. 1%、1/5000詹纳斯绿B溶液

称取50mg詹纳斯绿B溶于5ml Ringer溶液中，稍加微热(30~40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。取1%原液l ml加入49ml Ringer溶液，即成1/5000工作液装入瓶中备用。最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。

三、材料

人口腔上皮细胞，小麦种子或黄豆幼根根尖。

实 验 方 法

一、 人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察

清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上

↓

滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液

↓

用牙签口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞

↓

刮下的粘液状物放大载玻片的染液滴中

↓

染色10~l5min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液)

↓

盖上盖玻片,显微镜下观察

二、植物细胞液泡系的超活染色与观察

取豆芽的根尖

↓用刀片纵切根尖

放入中性红染液滴中，染色5~10min。

↓

吸去染液，滴一滴Ringer液

↓

盖上盖玻片进行镜检(镊子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察)

实 验 结 果

在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分，将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。

作 业

1. 绘口腔上皮细胞示线粒体的形态与分布

2. 绘蟾蜍胸骨剑突软骨细胞示液泡系的形态与分布

思 考 题

1. 用一种活体染色剂对细胞进行超活染色，为什么不能同时观察到线粒体、液泡系等多种细胞器?

答：不同的活体染色剂对不同的细胞器有染色专一性。詹纳斯绿B(Janus green B) 仅对线粒体具有专一性，而对液泡系没有专一性;中性红(neutral red)则对液泡系具有专一性，而对线粒体没有专一性。因此，用一种活体染色剂对细胞进行超活染色时，不能同时观察到线粒体、液泡系等多种细胞器。

2. 小麦或黄豆根尖经中性红超活染色，为什么看到生长点的细胞中液泡多，而且染色深，延长区细胞中液泡数量变少，染色浅?

答：因为生长点处的细胞分裂旺盛，且较小，处于新生阶段，故液泡数量多、染色深;而延长区的细胞已经成熟，细胞分裂能力下降，且细胞较大，因此细胞中液泡数量变少、染色变浅。

3. 高等动物和高等植物细胞中的液泡系(高尔基体)分布上有何不同?

答：高等动物中高尔基复合体一般都位于细胞核附近;而高等植物中高尔基体弥散于整个细胞中，不集中。