制作DNA ladder常见问题

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DNA Ladder是细胞凋亡 时产生的一些DNA片段，经过特定内切酶的酶切作用后，在电泳凝胶上产生多条核酸片段的条带，由于电泳图性状成梯形，因此称为DNA Ladder。DNA Ladder的产生与细胞凋亡密切相关，因此也可以利用DNA Ladder来判断细胞凋亡的标准。

例一

gongyulai ：我用的是药物诱导癌细胞凋亡，做DNA Ladder(用的是北京鼎国的动物细胞凋亡梯子提取试剂盒)。跑出来的电泳不是一条条带，而是每条很长的拖尾现象，Marker到是出来了。我是按说明书上0。8%的琼脂 糖。我用的是60v电压。不知道什么原因?郁闷。说明书上说混合温和是什么意思，我又没用力摇。我还想问收集凋亡细胞时离心时转速多少比较好?

chujun_hust ：

(1)“跑出来的电泳不是一条条带，而是每条很长的拖尾现象”： 可能是由于你点样时，时间太长了，导致样品扩散;还有一个原因是你设置的电压太高，最好是2~4v/cm，跑4～6小时比较合适

(2)“我是按说明书上0。8%的琼脂糖”：凝胶浓度太低了，把凝胶浓度加大到2%，放心做，没问题的

(3)“说明书上说混合温和”：那是怕你混匀太剧烈导致细胞基因组 DNA断裂啊，注意很轻轻的混匀

(4)“收集凋亡细胞时离心时转速”：我在实验室中是5000rpm，离心5min，我觉得足已

mmyycc ：我的ladder总是只有一条带，与对照组差别不大，用的是100v,1-1.5h,不知道是不是这个原因?溴酚兰跑到什么位置合适呢?

chujun_hust ：电压设置太高了啊，溴酚兰一般跑到蓝色离胶顶2cm左右吧。附上我刚刚做的DNA LADDER图象，我用的不是试剂盒，是按照《细胞实验指南》上做的，效果不错啊

具体见：http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=495351&sty=1&tpg=1&ppg=2&age=0#518411

lwk2003 ：请问做DNA LADDER时选择处理后细胞多长时间就可以提取细胞DNA比较合适?我看有的文献是处理细胞3天后提取DNA的，是不是时间太长了?

gongyulai ：我觉的根据不同情况吧。如果我是同一浓度不同时间测和不同浓度同一时间应该不一样的。

chujun_hust ：我觉得对于不同药物/不同剂量/不同细胞系,不同接种密度,细胞发生DNA LADDER的时间都不一样,所以最好是每隔12小时,或者24小时测量一次,我是每隔8h做的,连续奋战了3天3夜啊!然后根据跑电泳的结果决定什么剂量/什么时间,DNA LADDER效果最好!

例二

brainchip ：我现在正在建立凋亡细胞的凝胶电泳检测方法，可是几次实验的结果都不是很理想，我所以参考的方法是卢圣栋编著的分子生物学实验技术一书中记载的方法，但是结果不是根本检测不到]就是荧光太弱，看不太清。附加的是我用数码相机拍摄的最近一次电泳的照相结果。第二道好象有凋亡的ladder，如何才能使每次的荧光强度增高呢?我试过了增加EB的量和浓缩样品，加大上样体积都收效不大，是不是在样品处理收获DNA时应该注意些什么呢?第二道究竟是不是凋亡的LADDER呢?这种图象是不是可以达到发表要求呢?

wscoco78 ：我感觉你的样品凋亡率不是很高，我参照的是黄培堂编译的那本细胞实验指南(冷泉港)，和各种形形色色的方法比，最大特点就是不用酚氯仿抽提，而是Rnase和蛋白酶K消化后，直接点样电泳，这样做效果不错，你可以试试，再就是低电压。我以前试的那些方法我是没有做出来的!国内的书大概只是用来看的吧。

celia_xl ：想请教楼上，我也曾按照您所说的方法做过，但是加样时太粘稠了，怎么也加不进，还请从您的经验指导一下，有关用这个方法做凋亡所需要注意的地方。

wscoco78 ：呵呵，你看来也是那本书的读者，但是你应该注意到那本书所讲的，加样应在干孔中加，就是电泳槽没有上缓冲液之前加样，其实那本书所提示的每一小点都有它的作用，注意事项我不敢谈，好像也没什么特别的，如果对样品的凋亡程度信心不足的话，冷冻抽真空浓缩一下可能效果更好，不谢，希望你能顺利解决战斗，也希望破除DNA ladder难做的迷信，毕竟我也被这个东西折磨了老大一段时间，以为那些经典方法才是最好，其实抽来提去的，fragment早都丢完了，鄙视那些经典。

chujun_hust ：唉，我也为该选哪种方法而苦恼啊!但现在一个问题是SDS加入溶液后，溶液变浑浊，始终不能溶解，不知道是怎么回事啊?

wscoco78 ：你是加固体吗?!配成10%的SDS(pH8.0)，临用前加入裂解液(pH8.0)(final concentration 0.2-0.8%).

songkui2001 ：我也用此种方法做过了,其实这种方法的效果还是比所谓苯酚抽提法好一些又省力省东西.

chujun_hust ：(to wscoco78)我是直接加的SDS粉末的，具体配制过程如下：我是按照cell(1996)上一篇paper上配方NaCl:0.2M, EDTA:5mM, Tris-Cl:100mM(pH=8.5), SDS:0.2%(w/v)。我首先加tris-base然后搅拌溶解，然后再加NaCl搅拌溶解，然后在加EDTA溶解，此时溶液清澈，然后再加SDS，但溶液很浑浊，搅拌了很久还是很浑啊?难道必须首先配

好各自的溶液，然后再混合?

另：是不是配好溶液调PH值呢?还是等tris-base溶解后就调PH值呢?

brainchip ：(to wscoco78)依照你的方法在干孔加样时，将胶放进缓冲液中后总有一些会被液体浸泡出来，不知有何解决方法?另外你提到细胞的凋亡率不是很高，我在细胞收集的时候应用的是胰酶消化，是不是对结果有影响。是否有其他更好的细胞收集方法呢?

celia_xl ：(to wscoco78)我查阅文献后也有和您同样的感觉，采用传统的DNA抽提后小片断肯定会损失不少，所以我就采用这个改进的方法，但是试过后还是没有出结果，看来我看书还是不细。我也有和楼上兄台同样的问题，就是干孔加样后再将胶放入电泳槽后，原来加入的东西会漂出来，所以还请您多指教!

wscoco78 ：(TO chujun_hust)干吗非要把固体往裂解液里加呢?发cell的人太猛了，也许他是把SDS超微化了?：)我的裂解液是两种混合的，混合前就调到8.0,10%的SDS不用调，只要加几ul就行了，这个方法是endocrinology上的，也不算太差的杂志。

(1)我的早先的回答并不很准确，我问一位长江，他的解释是与凋亡程度无关，而是同一time point凋亡的细胞数有关，就是说其他检测方法检测到再多的凋亡细胞也不一定能用常规方法跑出ladder(3'H TDR /biotin label除外)，例如tunel法观察到大量的凋亡细胞而ladder没有的原因，因为他们不是集体自杀：)而是断断续续的自杀，小片段很多都降解了。很多protocol都是基于大量细胞接受凋亡诱导试剂的统一作用才能跑出ladder;

(2)我不敢说那种最好，但只有两种我作出来了，小分子片段选择性抽提和上文所讲到的方法，想来就是细胞没有大量同时凋亡。其中后者结果更好，但小片段抽提我也跑出来了，方法是和流式细胞术处理凋亡细胞的方法是同源的，就是：

1)细胞(组织适度匀浆)80% 乙醇固定过夜2-24h(室温-4。C);

2)800g4。C离心5min;

3)hanks 平衡液洗涤重悬;

4)再离心;

5)加入(192ml0.2mNa2HPO4+8ml0.1mol/L的柠檬酸pH7.8)混合液室温30min以上，间或摇匀，离心取上清，冷冻抽真空浓缩;(剩下的细胞PI染色还可以跑流式细胞仪测凋亡亚二倍体)

6)0.25%NP40,Rnase37C30min(3ul?多加点没关系)

7)蛋白酶K37C30min(3ul?多加点没关系)再浓缩浓缩

8)6xloading buffer 混合根据小片段液量自己选择(6-10ul)0.5xTBE里跑电泳

注意：DNA别降解了，混匀时tip头口剪宽一些，组织要多一些。

另：你们问我如何避免样品溢出，好像溢出不多啊，一丝一缕而已，至少我的ladder跑得出来，就把胶放在电泳槽里后再加TBE吧，不至于全流出来吧，还有就是用6X的loading buffer,可能可以增加比重，这也是书上的做法。要不把胶的孔做深点?

chujun_hust： (to wscoco78)看了您的帖子，我觉得还是用黄培堂编译的那本细胞实验指南(冷泉港)上写的方法去做，我昨天晚上完全按照上面的配方和步骤进行DNA LADDER分析了!

在做的过程有一些问题，想请教您!

(1)对于贴壁细胞是不是需要把漂浮细胞和贴壁细胞(胰酶消化)一起收集，离心，然后进行裂解分析啊???

(2)在配制细胞裂解液后(我这次是把EDTA,Tris-base,SDS放在一起搅拌混匀的，SDS溶解了)，使用pH试纸测得其pH值大概在8.0左右啊，好像根本不需要加HCL调pH值啊?您在配此溶液的时候是不是也是这样啊?

注：书上的配方中写的是100 mmol/L Tris，pH8.0，而不是100 mmol/L Tris-cl，pH8.0，我想大概是不需要加HCL的了，不知道我的理解对不对?

(3)加入20ul裂解液后，发现用移液管尖很难将细胞混匀啊，起了很多的泡沫啊，很且很粘稠?不知道怎么才能混匀啊?

(4)加入蛋白酶K后，溶液立即出现絮状白色物，不知道是何东西?(我现在是用未任何处理细胞做的)

(5)不知道在哪些步骤使用宽口吸头，比较合适?

(6)书上写的是RNA 酶A/T1混合液，我没有T1，只有Rnase(不知道是不是RNA 酶A?)，不知道是不是可以?

(7)全部完成后，我暂时不想电泳，不知道是不是可以放在-20度冰箱中保存，过几天再跑电泳啊?

另：不知道您参考黄培堂编译的那本细胞实验指南(冷泉港)的方案后，是完全按照上面做的，还是有修改?

wscoco78 ：sorry!chujun：

(1)我不知道你的情况，但既然都是培养细胞，自然都要拿来裂解，才能反映群体的凋亡情况;

(2)8.0就好，裂解液的配方多得去了，有这几种基本成分就行了，还可以加tritonx-100，只要你的试剂好(fluka、amresco、sigma)，照这些经典基本上都不需要调pH值，真的很准，上下0.5而已;你的理解经我实践是对的：)

(3)把枪尖浸入液面下，部分按下按钮，只是形成暗流，在液面下涌动，气体不放出来自然无气泡啊;

(4)蛋白酶K是冷的吧，加到50。C的裂解液自然会出现絮状物，再涌动涌动(同上)就消失了，不是什么怪现象;

(5)混匀时都用剪过的枪头吧(剪刀用酒精灯火焰过一下)，加东西时就不要用了，以免影响液体量准确性;

(6)我也没有：)只要是Rnase就行，那只是用来消灭5s的，没那么重要;

(7)可以。

我就是把裂解液里多加了tritonX-100，因为俺要做组织的，再就是裂解时间更长些，overnight也不怕，6xloading buffer多加些，比重增大，不会被buffer flush out，再就是冷冻抽真空浓缩到100ul以下。你的细胞我看可以更少些，50-60ul?

总体上就是该粗的就粗，该细的就就细。

wscoco78 ：肯定会做出来的，我上次马虎，把热的样品直接拿去抽真空，沸腾出来许多，剩下一点还是出来ladder，唉，我都佩服自己了：)你最好选择2～4V/cm电压，用大的电泳槽(10cm以上)，电泳过夜，当然别跑出去了，我是这样做的。

chujun_hust ：我看了很多文献，好像文献中琼脂糖凝胶的浓度好像有很多种啊(比如1.5%,1%,2%)不知道哪一种效果最佳啊?我的样品最终大概有50ul左右吧，不知道点多少在孔中比较合适?我这边的电泳槽最大的长度(阴极和阳极距离)为23cm，你说过夜，会不会跑出

去啊?你电泳时间大概多长啊?

wscoco78： 用0。8%都跑得出，当然是ladder的靠上部分，一般不要低于1。5%，用1。6%吧，我用的1。5%，但还不够理想，看来是要大一些。样品每孔我加20ul以上;照2v-3v/cm应该不会跑出去，你的长度也不会，就9个小时左右吧，你有手持的UV-detector吗?隔一段时间暂停电泳，照照看。做吧，只有在电泳中才能学会电泳。

midas： (TO wscoco78不要低于1.5%) 这么高呀!我用的是0.8%，45V跑4h。如果不要低于1.5%的话，是不是ladder部分拉不开呀，当然如果时间够长的话!

wscoco78 ：嗯，上次我是选择性抽提的小片段，用的0.8%,是好像条带清晰一些，不过1.5%我也跑出来过，我当时还用到了100bp的marker，所以才用了1.5%,chujun可以综合考虑，那

就0.8%~1.5%吧。

midas： 自己的实际经验比任何教课书都管用。

brainchip ：你们在做LADDER，收集贴壁细胞时，用的是什么方法收集的细胞，胰酶消化么?有没有更好的方法，因为有人说胰酶对已发生调亡的细胞的细胞壁有损害，可以减少凋亡的细胞

数量，是不是真有此事呢?

chujun_hust (TO brainchip)我是这样做的：首先把细胞培养液(大概1ml)收集起来，然后用胰酶消化35mm平皿中的细胞然后用PBS(1ml)进行吹打，然后收集在另外一个EP管中，然后一起进行4度离心，然后弃上清，将两管收集在一起，用PBS洗一次，然后就开始进行细胞裂解了!我不知道wscoco78是怎么做的，我也想知道更好的收集凋亡细胞的方法阿!

我今天进行了DNA LADDER的电泳(方法是按照细胞实验指南上面做的，参考了wscoco78的宝贵建议)，效果不错!发现这个方法真的不错，省力!

图像说明：两边的孔是加了lamda DNA marker的，第二、三孔(从左边数起)分别是两种细胞的对照组(即未任何处理过的细胞)，其它的是用顺铂处理细胞的不同浓度和不同时间点的样品，好像时间长了一点，有些已经跑出去了阿(电泳槽长度23cm，电压54V，时间6h)，另外对照组DNA怎么跑到上面去了，应该在点样孔附近阿?奇怪，难道是我在准备样品过程中，把基因组搞断了阿?大家帮我分析一下!

metarecu ：关于凋亡细胞的检测,凝胶电泳方法已基本被淘汰，该方法本身特异性并不高，建议采用其他方法!仅仅为了一种并不十分特异的方法而耗费精力，实在不值得!

例三

chujun_hust：我准备用DNA LADDER检测细胞凋亡，但是在配细胞裂解液过程中发现一个问题!我是按照cell(1996)上一篇paper上配方NaCl:0.2M, EDTA:5mM, Tris-Cl:100mM(pH=8.5), SDS:0.2%(w/v)

我首先加tris-base然后融解，然后再加NaCl融解，然后在加EDTA融解，此时溶液清澈，然后再加SDS，但溶液很浑浊，搅拌了很久还是很浑啊，不知道是怎么回事啊?难道必须首先配好各自的溶液，然后再混合?还有一个问题：等我溶液配好后，然后用HCL调pH值，但是使用了很多的HCL，溶液pH值还是很高(大概9左右吧)

zhaopeng110 ：SDS加后,肯定会很浑,因为细胞裂解,蛋白变性了,离心取上清就可以继续用酚/氯仿抽提了.酚/氯仿PH值一般都用8,上次,我的变成了PH=6.2,什么都没提出.

shawly2003：将每个溶液配成母液，混合起来就行了 (SDS最后加)。0。2%的SDS在0。2M的NaCl里一般是不会沉淀的，除非1)你配错了溶液，2)你的室温太低 (稍微加加热就行了)。

yuandong：我是按分子克隆第二版上配的，我就是一起加入后溶解的，不过我Tris用的不是Tris Base，而是Tris(不好意思，第一次配这玩意)，结果用NaOH调了很久。我在做的时候并没有沉淀，我把它分成两份，一份4度保存，另一份置于室温。结果在4度的变得浑浊，而室温却是清澈。

chujun_hust ，我也是将它用来做DNA Ladder的，我也不知道情况会怎样，还请以后我们多交流!

chujun_hust：我已经成功溶解了，上次是我溶液配错了，呵呵，觉得很好溶解的，我一般放在室温下很清澈。前几天按照wscoco78给我的建议，已经做出dna ladder了。

例四 结肠组织可以用DNA ladder检测凋亡吗?

coldant：在下想检测证实结肠肌层某一特殊间质细胞没有凋亡，用TUNEL法检测了，但都说一种方法太单一，说明不了问题，我是否可以再加用一种凋亡检测方法。我考虑提取结肠肌层DNA，琼脂唐凝胶电泳检测可以吗?

ljksbs：理论是应该可以的，但是需要将结肠组织给消化为单个细胞悬液后才可以做，而且要注意的是你要检测的是结肠肌层某一特殊间质细胞的调亡情况，因此在制备好细胞悬液后需要鉴定你的细胞悬液是你所需要的细胞，这就需要查文献根据你的目的细胞的特性或相应细胞因子来对细胞进行鉴定!而且做DNA Ladder要注意需要细胞数量要多!另外要注意的是：DNA Ladder是检测细胞晚期调亡的，如果细胞没有晚期调亡或晚期调亡率低的话，这种方法是不容易出结果的!因此你做之前要先确定你的细胞有没有晚期调亡!

一般来说，TUNEL做组织切片的调亡检测是比较经典的检测方法，如果条件允许的话，可以赏上个流式，不过这也要制备但细胞悬液!

另外可以加一个调亡的形态学检测!

coldant：制备细胞悬液不太现实，这种细胞太少了。“另外加一个凋亡的形态学检测”是指什么?

ljksbs：可是你要做DNA Ladder是要从细胞里提DNA，不制备单细胞悬液并且进行鉴定如何知道是你要的细胞，形态学检测可以用一个常规HE染色检查调亡组织中调亡细胞形态，这是比较常规的，也很简单!对于组织做调亡最经典的还是TUNEL，一般DNA Ladder用细胞系/株做比较合适!你还可以考虑做一个调亡检测的免疫组化，但是要买试剂：如bcl-2等!这也是比较常见的!

fffwu:我做的是内皮细胞凋亡，ecv-304，我用的是试剂盒，申能博彩的。dna的提取没问题， 但是我跑不出ladder，我用的是40v，1小时，胶的浓度是1。5%，

midas：增加时间到3h，胶的浓度可以减少到0.8-1.0%

lxh_lily:做过几次DNA ladder了，光镜下看到50%的细胞都脱落了，但是电泳结果只能看到一大片很亮的拖带，不能分出一条一条的ladder，我用的是1.2%的琼脂糖凝胶，恒流，60mA。是不是用page电泳效果会好一点?

midas：看来您的不是ladder,而是smear. 也就是necrosis。您的损伤可能太过激烈了!

在制备DNA Ladder和使用DNA Ladder来检测细胞凋亡中常常遇到很多问题，本文以问答的形式将在使用DNA Ladder过程中可能遇到的问题综合列举出来。为正在做这方面实验的研究人员提供帮助。