Native-PAGE常见问题

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1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 时预电泳是怎么回事的?预电泳时要加6×DNA上样缓冲液吗?电泳1-2小时再加结合反应产物吗?

预电泳是除去凝胶中没有聚合的单体和双体和聚合引发剂,提高分辨率,不加任何物质,一般30-60分钟后加样电泳.

2. 银染的步骤是什么?银染的关键因素是什么?

步骤是:

(1) 固定:10%冰乙酸30min.

(2) 清洗:双蒸水冲洗凝胶2次,每次1min.

(3) 染色:染色液(1g硝酸银,1.5ml 37%甲醛,1l 双蒸水.现配)染色30min.

(4) 清洗:迅速洗凝胶1次.

(5) 显影:30g碳酸钠,1.5ml 37%甲醛,200μl 10mg/l 硫代硫酸钠.显影至清晰带纹出现.

成功银染的关键因素包括:

(1) 用超纯水(比如,NANOpure或Milli-Q纯化)或者是双蒸水作银染.

(2) 用提供的碳酸钠或者ACS试剂级的碳酸钠.

(3) 在染色后,水清洗所用时间的长短很重要,用不超过5-10秒的时间清洗胶,然后放入显色溶液中,一般在水里浸一下就好.

(4) 甲醛和硫代硫酸钠(400μl/1ml)在使用前,及时加入到显色液中.

(5) 在使用前及时配染色液.

3. 变性PAGE的上样缓冲液配方?如何准备上样的蛋白?是将细胞用超声破碎,还是用细胞裂解液,大多细胞裂解液中均含有SDS,不知有没有用于非变性PAGE的裂解液.具有操作步骤是什么?

非变性的PAGE buffer就是0.5xTBE,上样缓冲液可以用普通的loading buffer,含有Tris,溴芬兰以及甘油即可,甘油是主要的沉淀作用成分.都可以自己配.细胞超声即可,超声后离心取上清.也有配NATIVE-PAGE gel所用buffer为undefinedTBE,用的running buffer也是undefinedTBE.还有一点就是要在配gel时考虑能使蛋白多聚体稳定的因素.

4. 做了naive---PAGE没有条带,蛋白质是纯品,分子 量很大,怎么回事呢?

因为分子量很大,8%的胶浓度较合适.加样时加个marker,可以检测胶制备是否有问题.银染方法比较灵敏,如果蛋白是一种酶,且可使某种底物显色的话,可以用活性染色试试,更灵敏.