2D电泳结果疑难解析
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生命科学领域发生的革命性变化，对生命活动的研究正在从传统的还原式研究转向了整体性的研究——以基因组 学(功能基因组学)和蛋白质组学为基础的系统生物学。其中蛋白质组学包括表达蛋白质组学(expression proteomics)、结构蛋白质组学(structural proteomics)和功能基因组学(functional proteomics)。而双向电泳则是蛋白质组学，尤其是表达蛋白质组学的经典方法。
由于双向电泳对于许多研究人员来说是个陌生的技术，所以一旦在电泳染色后出现费解的电泳图是件令人头痛的事：不知道问题出现在哪，也不知道如何去改正。这里来自GE公司的专家列出了几种常见出错电泳图，虽然不是非常全面，但是如果您也在实验中遇到了这样的问题，希望能从这里得到参考。
首先，来看看漂亮的2D电泳图
<center> <img alt="2D电泳结果疑难解析" height="384" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/09/06/A1378378984.jpg" width="482" /></center>问题1. 氨基甲酰化(Carbamylation trains)导致太多蛋白斑点串，不属于常规的磷酸化等修饰
| #FormatImgID_1# | #FormatImgID_2# |
可能原因：尿素(urea)不纯
建议：用更纯的尿素，避免样品加热，或者用Amberlite IRN-150L去异氰酸盐(isocyanate)
问题2. 蛋白样品制备步骤错误导致蛋白丢失
<center> <img alt="2D电泳结果疑难解析" height="437" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/09/06/A1378378986.jpg" width="423" /></center>可能原因：样品制备TCA/丙酮沉淀后用预冷的丙酮洗涤沉淀，导致TCA残留
建议：用90%丙酮/10%H2O洗涤,可以彻底洗去TCA
问题3.不同的样品制备步骤导致完全不同的蛋白斑点图谱
对于样品制备而言，没有一个固定的方法，更多的时候要根据样品的特性，以及一些文献的参考进行优化，下面是一个植物 样品的例子：
| #FormatImgID_4# | ||
| 若采用常规的标准裂解液，样品溶解不充分 | 用甲醇沉淀后复溶，效果也不明显 | TCA/丙酮沉淀较适合这一样品 |
4.正常情况
正常情况，右边的垂直条带包含了所有pIs值>pH7的蛋白。
问题5. 样品含高丰度蛋白导致出现水平条带
<center> <img alt="2D电泳结果疑难解析" height="299" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/09/06/A1378378988.jpg" width="458" /></center>可能原因：高丰度蛋白聚集后，若采用胶面朝下的胶条槽，易造成水平条带。
建议：采用杯上样胶条槽或manifold等胶面朝上的胶条槽。
问题6. 出现水平条带(窄pH范围胶条)
<center> <img alt="2D电泳结果疑难解析" height="355" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/09/06/A1378378977.jpg" width="469" /></center>可能原因：聚焦不够，或者盐离子过多
造成水平条带的其它原因：
Detergent去污剂浓度过低
尿素浓度过低
DTT浓度过低，或者用量过少
上样位置不合适(比如cup loading)
蛋白酶活性
胶条溶胀时间过短
样品中含有不溶的蛋白(centrifuge 1 hr / 40,000 g)
空气中的CO2
问题7. 试剂不新鲜
<center> <img alt="2D电泳结果疑难解析" height="371" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/09/06/A1378378981.jpg" width="432" /></center>可能原因：TEMED不新鲜。
建议：尽管TEMED用量很少，还是建议每年更换一瓶TEMED。
问题8.试剂质量影响蛋白斑点成像
<center> <img alt="2D电泳结果疑难解析" height="438" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/09/06/A1378378980.jpg" width="415" /></center>可能原因：Tris质量不好
问题9. 步骤错误导致蛋白丢失
<center> <img alt="2D电泳结果疑难解析" height="326" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/09/06/A1378378987.jpg" width="420" /></center>可能原因：蛋白转移电压过高(400V，18cm胶)——在开始的45分钟内不要超过2W/gel(Ettan size)
问题10. 植物样品制备
<center> <img alt="2D电泳结果疑难解析" height="235" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/09/06/A1378378978.jpg" width="288" /></center>可能原因：多糖未去除干净，被考马氏亮蓝染色
建议：样品用clean-up处理
问题11. 蛋白斑点出现垂直条带
<center> <img alt="2D电泳结果疑难解析" height="345" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/09/06/A1378378982.jpg" width="396" /></center>可能原因：平衡过程中DTT不足，导致一些蛋白出现垂直条带。
问题12 样品中含盐等离子过高
<center> <img alt="2D电泳结果疑难解析" height="249" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/09/06/A1378378985.jpg" width="374" /></center>可能原因：样品中含盐等离子杂质过高，导致等电聚焦失败。
建议：避免过多盐，需除盐，如在洗细胞时要把PBS在离心后彻底移除，或在最后一步清洗时采用250mM蔗糖/10mM Tris 洗细胞。
问题13 pH6-11的胶条
<center> <img alt="2D电泳结果疑难解析" height="247" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/09/06/A1378378976.jpg" width="288" /></center> <center> <img alt="2D电泳结果疑难解析" height="246" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/09/06/A1378378979.jpg" width="314" /></center>Rehydration Loading Cup loading
建议：对于碱性pH范围胶条，用杯上样效果更好
问题14 保存第二向凝胶时温度太低
<center> <img alt="2D电泳结果疑难解析" height="344" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/09/06/A1378378983.jpg" width="408" /></center>可能原因：保存第二向凝胶时温度太低， SDS有沉淀
建议：长时间保存(2days - 2weeks)在4-8oC， 在二向进行前应提前把凝胶取出，室温放置。
如有更多问题，欢迎到生物通bbs讨论。(以上胶片由GE Healthcare专家提供)
