2D-PP 分离磷酸肽

即使纳喷 MS/MS 技术已经成功用于直接分析蛋白酶解产生的磷酸肽但是出于以下一些原因，通常建议在质谱分析前作一些分离：

(1) 磷酸肽在蛋白酶切产物中通常只占少数因此容易淹没在低率度离子产生的总背景中，肽分离技术可浓缩分析物，因此会提高信噪比。

(2) 如果磷酸肽被放射性标记并具有相同比活度，那么每一个被分离的肽段相应的活度计数就表明这一组分中磷酸肽的相对量，，如果已知所用放射性标记物的比活，就能容易地算出磷酸肽的绝对值。

(3) 放射性标记的磷酸肽的分离谱可以用来定量检测不同时间或细胞肽态下蛋白质磷酸化肽态的变化。

(4)肽分离方法也有效地除去了非肽类杂质，更有利于检测和分析低丰度磷酸肽。

在现有的分离技术中，2D-PP, RP-HPLC,高分辨凝胶电泳和固相化金属亲和色谱(immobilized metal affinity chromatography, IMAC) 被优先选择用于分离磷酸肽，虽然要阐明一个明确的策略用于鉴定所有磷蛋白很困难（图 5.5), 但做一个一般性策略的论述还是有价值的。但即使是图 5.5 策略中的内容也没有包含所有可能的途径。任何一个鉴定方案的细节都与许多因素相关，例如个人对检测和分离模式的喜好，可得到的样品及可用的仪器。但总规则是先要得到序列信息，可通过 MS 或 MS/MS方法对体外 2D-PP上的点直接分析，两者都能得到有用的信队如果某些点或全部点的序列分析不成功，那么重新水解蛋白质，肽段经 HPLC 分段收集，然后用 MS/MS 分析含³²p的组分，可用自动或直接分析方法。如果由于 MS 信噪比糟糕而不能得到 2Dpp 上的点的序列信息，那么 HPLC 收集的组分本质上会更干净，也许会得到好的数据。如果磷酸化的化学计量值非常低，这种 HPLC 制备方法也许会失败，可能会观察到磷酸肽，但是柱上浓度会很低．以致不能产生可用于解析的碎片离子；这种情况下再重复水解蛋白质，用IMAC 富集磷酸肽，用 lMAC 的收集组分做 MS/MS 实验。不管第一步使用了什么方法，通常从蛋内点到蛋白水解这一步都要进行多次重复，直到所有感兴趣的磷酸肽都被测序。要记住，某些肽序列不会以易于解析的方式断裂，为了测量确切的磷酸化位点，有必要使用合成肽。这一标准品用于比较研究以证实确切的磷酸化位点。当 ³²p不能掺入蛋白质时，要用下面提到的诊断离子扫描来检测用于序列分析的磷酸肽。这里提到的及图 5.5 所示的每一个分离技术都与下面提到的肽的进一步化学、酶及质谱分析方法相适用。

在 2D-PP 谱中，肽段的 4维分离是在薄层纤维板上进行电泳，二维分离是在相同的板上进行薄层色谱已分离到的磷酸，肽经放射自显影或瞬储屏检测。放射自显影看到的点的数目可用来估计磷酸化位点的最大数目，点的强度可用来指示肽之间磷酸化的相对化学计量值。此外，即使并非能够分辨所有的肽但样品中每一个磷酸肽都被计数。观察到的点的数目没必要与磷酸化位点的数目直接相联系，因为磷蛋白中经常可观察到不完全的蛋白水解。但2D-PP 图谱也提供了从其他方法中得不到的有关蛋白质磷酸化位点的重要信息，包括：

(1) 磷酸化位点的最大数目。由于蛋白酶水解差异，谱图产生的点通常多于磷酸化位点。

(2) 放射自显影强度提供了在所有磷酸肽中磷酸化的相对化学计量。

(3) 电泳和 TLC 的正交分离提供了磷酸肽之间亲水性的相对肽态，2D-PP 作图的另一个优点是能产生纯化的磷酸肽，从平板上提取时可用 MS 分析, 如果试图用 2D-PP 作图法作为 MS/MS 分析的样品制备方法，那么所加蛋白酶的量要少，只要能发挥作用即可。 如使用过量的蛋白酶，在 MS 分析磷酸肽时，蛋白酶的自切产物会占据图谱的主导，抑制了磷酸肽的分析。此外， 2D-PP 作图法的灵敏高且重现性好．因为检测磷酸肽是通过整合相当长时间内的放射性衰变，所以方法非常灵敏，并且灵敏度只依赖于放射性标记物的比活。 2D-PP 所获得图谱的高度重现性使其被选择用于分析不同环境，例如不可时间过程，不同活性诱导肽态下蛋白质的磷酸化状态。