幽门螺杆菌实验室诊断进展

 

幽门螺杆菌实验室诊断进展

　　自从上世纪末Eizzero和Salomon首先在胃粘膜发现螺旋形细菌以来，许多学者对这种细菌做了研究，都未能揭示其病理学意义。直到1983年和1984年，Marshall和Warren从组织上在胃炎和胃肠道疾病患者的胃粘膜发现弯曲菌（CLO），在微需氧条件下培养出CLOs，命名为幽门弯曲菌（Campylobacter pylori-CP），后更名为幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）并证实Hp与 慢性胃炎 和消化性溃疡密切相关，可能为其病原体。此后，Hp引起胃肠学家、病理学家和微生物学家们的极大兴趣。经过十多年的努力，Hp的实验室诊断从组织学、微生物学、超微结构检查、尿素酶快速诊断发展到 ¹³ C与 ¹⁴ C尿素呼吸试验，血清学免疫抗体检测和聚合酶链反应（PCR）。超微结构检查证实了Hp是 慢性胃炎 的病原体，尿素酶呼吸试验和血清免疫抗体检测和PCR可作为内窥检查前的筛选，有利于Hp流行病学，发病机理、临床治疗和药物疗效评定研究。

1　病史询问和体检

详细的病史可发现感染的来源或和胃炎“已知的”原因或弯曲菌感染的关系。主要详细询问动物接触史、旅行、食物、口腔卫生、吸烟习惯、酒精消费量和药物（抗酸制剂药量）。特别是患者的详细病史和症状（上腹痛、恶心和烧心感）及详细的上腹部触诊。

2　内窥镜检查

　　内窥镜检查前至少禁食4h，仔细检查胃和十二指肠后进行常规活检，从离幽门2cm～5cm内的窦部或离局灶性损害一定距离的粘膜活检5块标本。当胃粘膜有炎证时应从潮红的区域活检。2块立即固定于福尔马林磷酸盐缓冲液送组织学检查，另2块置于冷却的压氧运送液，在1h内送微生物学实验室培养。最后一块插入“CLO―test box（幽门螺杆菌 试剂 盒）通过尿素酶活性检Hp。活检标本必要时可送超微结构检查。根据病灶和实验目的不同也可以从胃底和胃体分别活检。

3　组织学检查

活检标本经石蜡包埋切片后，选用Warthin－Starry、HE，GiemSa、吖啶橙、Gimenez，Brown-Hopps卡宝品红染色法进行染色，然后在光学显微镜或电镜下观察Hp的形态、数量和分布。Warthin－Starrg银染色法是经典的最常用的Hp染色法。Hp是黑色颗粒状外观，可与银沉淀颗粒混淆。Giemsa染色时Hp外观平滑呈纯紫色。虽有背景染色，但细菌形态清晰、染色单一易辨认。Brown－Hopps染色能极清楚地观察胃腔内粘液（黄色或稻草色）里的细菌（紫红色），确定粘液里和粘液外细菌的相对密度和粘液层的厚度，有利于估计入侵细菌的数量，吖啶红是一种能与核酸结合的荧光色素。Hp在表面粘液层腺体表面呈淡桔红色荧光，某种情况下，也可见于细胞内粘液。吖啶橙可以更好地鉴定Hp的特征性形态学。

高倍显微镜下，Hp为弧形成螺旋状弯曲样细菌。可根据Hp分布的数量和密度进行半定量测定，Marshall将Hp感染分为四级：0级：无特征性细菌；Ⅰ级：仔细寻找偶有细菌发现；Ⅱ级：大多数高倍视野发现散在分布的或偶有成丛的细菌；Ⅲ级：大多数高倍视野发现大量的细菌。电子为微镜下，Hp是一种长3μm，宽约0.5μm弯曲细长或螺状细菌，包膜光滑，有4根从细菌一端发出的鞘型鞭毛，每根鞭毛有一个终球，每个极没有明显的陷窝压迹。鞭毛和终球称为浆。Hp单一或成丛地分布在胃上皮细胞腔面，包括胃陷窝，常位于粘液深层，接近胃窦上皮细胞平滑膨出的胞浆膜。

4　微生物学检查

　　活检标本先涂片革兰色观察Hp，其余组织研碎后接种在绵羊血琼脂或巧克力琼脂，最理想的培养或含万古毒素6mg/L，萘啶酸20mg/L，二性毒素2mg/L，可抑制污染细菌而不抑制Hp生长。Hp需在微需氧条件（CO ₂ 10％，O ₂ 5％）温度37℃下培养5d～7d，出现典型Hp菌落为阳性、7d后幼稚菌不生长为阴性。Hp菌落呈直径1mm，没有色素的透明薄层。涂片观察可见Hp为直径约0.5μm，长度2.5μm，外观1或2个波长的螺旋体。某些细菌的鞭毛可见于两端，在阴性染色剂中有球根状尖端。在人工介质中，细菌常比新鲜组织革兰染色中所见的Hp大，弯曲度较小。

　　化生试验：氧化酸＋，触酶＋，H ₂ S＋，尿素酶－，吲哚－，硝酸盐－，不发酵葡萄糖。对萘啶酸耐药。DNA硷基分析鸟甙＋胞嘧啶含量为36mol％，螺杆菌范围的值。

5　幽门螺杆菌尿素酶快速诊断

Morris et al将一块胃或十二指肠活检标本插入小块尿素琼脂，由于尿素酶的作用，改变琼脂的pH值，使琼脂由黄色变为粉红色，阴性者颜色不变。应用CLO―test，67％Hp感染在15min内诊断，72％1h内，90％3h内诊断。Varira et al改良后4h RUT Hp检出特异100％，敏感性89％。对窦部活检标本的特异性和敏感性分别为100％和92％。假阳性结果可能由于标本里的细菌数量少。他们指出，4h RUT阳性即可开始治疗。Arrinf et al报告Hp的1min尿素酶试验结果，21例标本，19例阳性，没有假阴性报告结果。上述结果表明，Hp感染的尿素酶快速诊断是一种方便可靠的方法。

6　13C-尿素呼吸试验

　　Graham et al利用Hp内源性高效尿素酶活性作为诊断Hp的非入侵性试验。试验前先口服 ¹³ C－尿素、尿素分解产物的 ¹³ CO ₂ 出现在Hp感染患者呼出的CO ₂ 中，持续时间＞100min。26例中，每一例阳性呼吸试验，粘膜活检标本培养或Warthin－Starry银染色阳性，或二者都阳性。14例慢性呼吸试验提示Hp感染者中，13例银染色发现细菌，13例培养阳性。Hp感染被发现于20％正常无症状志愿和25％非溃疡性消化不良志愿者。12例十二指肠溃疡患者中，仅10例发现Hp感染。2例呼吸试阴性溃疡患者，即没有培养性，也没有组织学阳性。

　　7　 ¹⁴ C－尿素呼吸试验

　　G．D．Bell et al ¹⁵ 叙述了 ¹⁴ C－尿素呼吸试验，方法如下；夜间禁食后患者饮用350ml液体和20ml水加0.4MBg ¹⁴ C尿素（Amersham International），2h内定期收集呼吸标本。应用液体闪烁记数器测定呼出CO ₂ 中的 ¹⁴ C，计算曲线以下区域、用作表示 ¹⁴ CO ₂ 累积排出量。 ¹⁴ CO ₂ 迅速出现在Hp阳性患者的呼气中。高峰排出在摄入 ¹⁴ C尿素后的10min―60min；非常低但易于发现。在对照组中记录 ¹⁴ C尿素。患者在任何10min标本产生75％以上所给剂量每mmol的CO ₂ 剂量×体重。所有Hp阳性患者在第一小时至少有一个标本产生超过1.19， ¹⁴ C尿素呼吸试验可靠地区别Hp感染或不受Hp感染的患者。铋剂治疗因其对Hp的杀灭作用在 ¹⁴ CO ₂ 呼吸试验中曲线明显下降。

　　 ¹³ C是非放射性同位素，无放射性，因测验时病人无不适感觉，故幼儿可受试，但使用测定 ¹³ CO ₂ 回收所需要的大型 质谱 仪和试剂较昂贵，在地区综合医院是不可能接受的。而 ¹⁴ C尿素呼吸试验需要闪烁计数器，价廉易被接受，但 ¹⁴ C有放射性，而且半衰期很长，不宜应用于儿童和孕妇。因此，非入侵性 ¹⁴ C尿素呼吸是一种简便，价廉和可以监测各种药物对Hp感染作用的方法。

8　DNA位点杂交技术检测胃内Hp

Van den berg et al研究了非放射性DNA位点杂交（DISH）探针（probtocol），即应用辅酶R化的Hp DNA作为探针检出常规包埋的胃活检标本里Hp的DNA。在从一例58岁复发性慢性活动性胃炎的女性所获得的连续标本中，Hp探针和细菌杂交、除一个标本例外，当组织学上无可见的细菌时，杂交阴性。在一个无可见的Hp单一活检标本和胃窦表面进行杂交，而和异质性探针的对照杂交仍阴性。从一块同时获得的活检标本，Hp培养结果阳性。虽然DISH比HE、银或Giemsa染色更复杂，但更敏感，其优点，①非常容易发现Hp，尤其当切片无对照染色，甚至Hp少量存在时；②杂交细菌明确地鉴定为Hp，而不仅仅鉴定为Hp；③从同一区域的胃窦获得的标本培养阳性，DISH在上皮表面发现Hp的DNA杂交而组织学上在这人位置来证实Hp存在。

9　Hp的血清学研究

1986年Wyatt et al首先在54例活检标本应用IgA、IgG和IgM免疫过氧化酶染色研究活体宿主免疫球蛋白包裹的Hp。IgA包裹的Hp见于所有病例的活动性胃炎。其中60％的标本上皮内没有嗜中性细胞，许多非活动性胃炎IgG或IgM包裹或二者都包裹的Hp与胃炎活动相关，在没有嗜中性细胞浸润的标本中罕见。IgA通过干扰细菌粘着在上皮表面，保护粘膜。活动性胃炎和IgM和IgG包裹的Hp的相关性是Hp引起炎症反应的确凿证据。Hp在所有年龄和所有分级胃炎患者的感染提示，一旦细菌种植后便可以永久存留。因此宿主免疫反应对于根除细菌是无效的。Hp在胃陷窝深部的隐藏处，可以避免与至少足以被免疫过氧化酶技术发现的浓度的免疫球蛋接触。在活检标本中H