用淋巴细胞分离液分离单个核细胞

用淋巴细胞分离液分离单个核细胞

1 ）分离外周血中的单个核细胞（ PBMC ）

1． 抽取正常人静脉血加到肝素抗凝管中，加等量含 5 ～ 10IU/ml 肝素的无血清缓冲液悬浮细胞。将细胞悬液小心加在与血液等量的淋巴细胞分离液上，室温中，水平离心 500 × g 20 分钟。此时离心管中形成 5 层：最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是 PBMC ，淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞层之间是粒细胞层，又成为棕�层。

2． 吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出 PBMC 。加 1 ～ 2 倍量含 5IU/ml 肝素、 2 ％灭活小牛血清的 Hanks 液（洗涤液），混匀后离心 200 × g 10 分钟，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。

3． 再用同样洗涤液洗涤细胞 2 次，每次离心 500 × g 10 分钟，洗去残留的淋巴细胞分离液。用 1 ％台盼蓝染色检测细胞活力（应 >95 ％）并计数细胞。再用含 10 ％小牛血清的细胞培养液将细胞配成适当浓度。通常，每毫升外周血可得 1 × 10⁶ ～ 2 × 10⁶ PBMC 。

2 ）分离关节滑液中的单个核细胞

1． 将关节滑液置含肝素（终浓度 5IU/ml ）的离心管中，离心 1000 × g 15 分钟。

2． 用含 2 ％灭活小牛血清的 Hanks 液悬浮沉淀细胞并洗涤细胞 1 次，每次离心 1000 × g 15 分钟。用含 2 ％灭活小牛血清的 Hanks 液悬浮细胞至原容量。

3． 用淋巴细胞分离液分离关节滑液中的单个核细胞，并用含 10 ％小牛血清的细胞培养液将细胞配成适当浓度。

3 ）分离组织中的单个核细胞

1． 取外科分离的各种组织，用含 1 ％庆大霉素和 1 ％小牛血清的 MEM 培养液洗涤组织块，洗去可能的污染物。将组织块置培养皿中，加入约为组织块体积 5 ～ 10 倍的同样 MEM 培养液。用无菌外科剪刀将组织块剪碎成 0.5mm³ 大小。

2． 将组织块转移到小培养瓶中，静置片刻，吸去培养液。加入约 2 倍组织块体积的、滤过除菌的酶溶液。 37 ℃水浴摇床中消化 1 ～ 2 小时，注意组织块的消化程度。

3． 当组织块消化分散后，用手用力摇晃培养瓶 3 ～ 5 分钟或用大口吸管反复吹打，使细胞团进一步分散。加入 30ml 上述 MEM 培养液，终止酶反应。

4． 让上述悬液通过 200 目的金属网或尼龙网，分离单个细胞。用上述 MEM 培养液洗涤细胞 3 次，每次离心 1000 × g 10 分钟。用 1 ％台盼蓝染色法检测细胞活力并计数细胞。

5． 如果细胞量较多（ >10⁷ ），应当用上述淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，并用含 10 ％小牛血清的细胞培养液将细胞配成适当浓度。

4 ）从小鼠胸腺中分离胸腺细胞

1． 脱臼或剪头处死小鼠，置 75 ％乙醇中浸泡消毒。腹面向上固定，剪开小鼠胸腔，暴露和摘取胸腺。在平皿中用 Hanks 液洗净血液，去除结缔组织。

2． 在有少量细胞培养液的平皿中，用镊子梳理胸腺，再用大口吸管反复吹打，分离单个细胞。离心沉淀细胞，用细胞培养液洗涤细胞 1 次。加入适量细胞培养液，静置 5 分钟，让大的组织块自然沉降，吸出单个胸腺细胞。

3． 用 1 ％台盼蓝染色法检测细胞活力，计数细胞。再用含 10 ％小牛血清的细胞培养液将细胞配成适当浓度。