特染： 结缔组织染色

一、Mallory三色染色法
1. 试剂配制
（1）重铬酸钾液 重铬酸钾2.5g，醋酸5ml，蒸馏水95ml
（2）苯胺蓝桔黄G液 苯胺蓝0.5g，桔黄G2g，磷钨酸1g，蒸馏水100ml
（3）酸性复红液 酸性复红0.5g，蒸馏水100ml
2.染色步骤
（1）中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。
（2）重铬酸钾液10min。
（3）蒸馏水冲洗2min，蒸馏水2次。
（4）酸性复红液2min，蒸馏稍洗。
（5）苯胺蓝液20min，95%乙醇快速分化。
（6）直接用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
3.结果
胶原和网状纤维呈蓝色，软骨、粘液、淀粉样变物质呈淡蓝色，神经胶质纤维、肌纤维和酸性颗粒呈红色，髓鞘和红色呈桔红色。
4.注意事项
（1）酸性复红液易溶解于水，肉眼观察切片上保留一定的红色。
（2）苯胺蓝液染色后，用95%乙醇分化时，须用显微镜观察掌握。
（3）对陈旧的固定标本，其染色效果较差，可增加染色时间。
（4）另张切片，可同时作胶原纤维对照染色而进行鉴别组织成分。
二、Masson三色染色法
1.试剂配制
（1）Masson复合染色液 酸性复红1g，丽春红2g，桔黄G2g，0.25%醋酸300ml。
（2）亮绿染色液 高绿SF0.1g，0.2%醋酸100ml。
2.染色步骤
中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。
（1）Masson复合染色液5min。
（2）0.2%醋酸水溶液稍洗。
（3）5%磷钨酸5-10min。
（4）0.2%醋酸水溶液浸洗2次。
（5）亮绿染色液5min，0.2%醋酸水洗2次。
（6）无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
3.结果
胶原纤维呈绿色，肌纤维呈红色，红细胞呈桔红色。
4.注意事项
（1）Masson复合染色液，经磷钨酸分化时须用显微镜控制肌纤维清晰为止。
（2）亮绿染料可用苯胺蓝替换，可用来作为对比观察染色的效果。
三、显示胶原纤维、网状纤维和弹力纤维的三联染色法（1993年）
1.试剂配制
（1）高锰酸钾硫酸液 0.5%高锰酸钾水溶液中加入5ml的硫酸。
（2）维多利亚蓝染色液 维多利亚蓝2g，糊精0.5g，间苯二酚4g，蒸馏水200ml。将上述物质混合后加热煮沸，边煮边搅拌，约5min。然后用另一容器取30%三氯化铁水溶液25ml，另行加热煮沸后慢慢倒入上述混合液中继续煮沸3min，不断搅拌溶液呈胶体状。去火冷却过滤，将滤纸上的残渣连同滤纸放在60℃恒温箱中烤干。残渣呈深蓝色细颗粒状粉末，再溶于400ml的70%乙醇液中。然后加浓盐酸4ml和苯酚5g放置至成熟后使用。
（3）丽春红染色S染色液 0.5%丽春红S水溶液15ml，苦味酸饱和水溶液85ml。
（4）Gomori氨性银改良液 取5%硝酸银水溶液5ml，滴加浓氨水由棕黑色变清为止，再加入3%氢氧化钠水溶液5ml，此时该液突变紫黑色，这时再加入氨水使之变清晰为止。最后用蒸馏水补足至50ml，盛棕色试剂瓶中，置于冰箱中备用较长时间。
2.染色步骤
（1）中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。
（2）高锰酸钾硫酸液氧化3min后，自来水浸洗后，用2%草酸漂白2min。
（3）5%硫酸铁铵1min。
（4）Gomori氨性银改良液染1min。
（5）蒸馏水洗2次，用15%甲醛液还原1min。
（6）蒸馏水洗2次，0.2%氯化金30s，蒸馏水洗1次。
（7）70%乙醇浸一次，再浸入维多利亚蓝液中染30min-1h。
（8）95%乙醇分化1min左右。
（9）浸入蒸馏水中1min后，用丽春红S染色液染色2min。
（10）直接用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
3.结果
胶原纤维呈红色，网状纤维呈黑色，弹力纤维呈绿色，肌肉和红细胞呈淡黄色。
4.注意事项
氨性银液滴染时，要用干净吸管，防止银液污染而发生沉淀。氨性银液作用后的切片不能倾倒，应将蒸馏水冲洗切片上的银液，这样就不会使银液表面挥发的银颗粒而沉积在组织上。
第二节 胶 原 纤 维
一、胶原纤维的分布和组成成分
胶原纤维是结缔组织中的三种纤维之一，分布最为广泛，含量最多。主要分布于真皮、键、韧带、骨、透明软骨、动脉、肠壁、子宫和基底膜等，胶麻纤维具有韧性大，抗拉力强的特点。在弱酸或沸水中可慢慢溶化成胶水，称白明胶。胶原纤维和网状纤维的基本构造相似，都以胶原单位(蛋白质为主的大分子)为基本单位。胶原单位接连和融合形成网状纤维;它是粗约1μm左右的分支状纤维，形成全身组织的支架，在HE染色中看不清楚。但其外面裹着的一层类蛋白，凭借镀银法可以清楚地显示出来，故又称为嗜银纤维。
胶原纤维单位主要由纤维母细胞合成。其他如平滑肌细胞等也能产生。胶原单位的形成开始于细胞的粗面内质网，合成比构成胶原单位的α肽链更长的前α肽链，经高尔基体分泌出细胞，在细胞外液的内切肽酶作用下，切去前α肽链的附加肽段而形成胶原单位；再经细胞外液的赖氨酰氧化酶作用使两条肽链通过醛醇或醛胺缩合构成共价交联。这样胶原单位分子之间就形成了稳定的联系，形成胶原微纤维，然后再聚合而成胶原纤维。
二、胶原纤维染色的应用
胶原纤维染色在病理诊断上主要用于鉴定梭形、纤维形细胞肿瘤的组织来源：常常要在纤维、平滑肌和神经三者之中作出选择。还能使用于其他的情况下，如观察动脉硬化的心脏，在HE切片中，心肌内散在的小疤痕灶和心肌均被染作红色，而作胶原纤维染色可将胶原组织和心肌组织明显地区分开来。早期肝硬化用胶原纤维染色，也可使小叶之间少量增生的胶原纤维突出地显示出来。由干胶原纤维是由成纤维细胞产生的一种纤维蛋白成分，常常被酸性染料染色。
l. Van Gieson苦味酸酸性复红法(1889年)
[试剂配制]
(l) Van Gieson液 l%酸性品红水溶液10ml，苦味酸饱和水溶液(约l.22%)90ml。
(2)Weigert铁苏木素溶液 甲液：苏木素lg,95%或无水乙醇100ml；乙液：29%三氯化铁水溶液4ml，蒸馏水95ml，盐酸l ml。
临用时取甲液和乙液等量混合即可。铁苏木素不能像明矾苏木素一样配制后放置，因铁与染色剂的色素可引起化合而形成不溶性沉淀。所以，以铁作为媒染液时，必须与染液分别配制、分别应用或临时混合应用。
[染色方法]
(1)组织固定于10%甲醛液，常规脱水包埋。
(2)组织切片脱蜡至水。
(3)用Weigert苏木素液染5~l0min。
(4)自来水冲洗数分钟。
(5)根据染色的深浅可用0.5%盐酸乙醇分化。
(6)自来水洗至变蓝；用蒸馏水洗。
(7)用Van Gieson液染1~5min。
(8)倾去染液，直接用95%乙醇分化和脱水。
(9)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果] 胶原纤维呈红色，肌纤维、胞质及红细胞黄色，胞核呈黑色。
[注意事项]
(1)目前以苦味酸、复红的Van Gieson染液直接染此一种溶液即可。
(2)Weigert铁苏木素分甲、乙两液，应于临用前将两液等量混合使用，而不宜预先混合，否则易氧化沉淀而逐渐失其染色能力。
(3) Van Gieson染色液分别在临用时混合，防止放置时间长，则酸性品红不易着色。
2. Siriured染色法
这种方法可使胶原纤维长期保存，是不易褪色的一种好方法。
[试剂配制]
(l)Siriusred 饱和苦味酸液 0.5%Siriured l0ml，苦味酸饱和液90ml。
(2)天青石蓝液 天青石蓝B1•25g，铁明矾1.25g，蒸馏水250m1。
溶解煮沸，待冷过滤后，加入甘油30m1，然后再加入浓盐酸5ml。
[染色方法]
(1)组织固定于10%甲醛液，常规脱水包埋。
(2)切片脱蜡至水。
(3)入天青石蓝液染5~10min，
(4)蒸馏水洗多次。
(5)Siriured饱和苦味酸液染15~30min。
(6)无水乙醇直接分化与脱水。
(7)二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果] 胶原纤维呈鲜红色，细胞核绿色，其他为黄色。
3. Lillie改良Van Gieson法(1965年)
[试剂配制]
A. 用1%醋酸配成0.1%快绿FCF 液，或为得到较蓝的绿色用3%毛绿S(Wool greenS )。
B. 且0.2%酸性复红，0.2%紫胺(Violamine)或用0.1%~0.5%丽春红S(ponceau S) 溶于饱和的苦味酸水溶液。
[染色方法]
(1)按常规将切片脱蜡至水。
(2)用Harris明矾苏木素液染3min。
(3)自来水洗，盐酸乙醇分化数秒钟。
(4)自来水洗至显蓝，蒸馏水洗。
(5)在A溶液中染4min。
(6)在1%醋酸中洗2次。
(7)在B溶液中染l0~l5min。
(8)在1%醋酸中洗2min。
(9)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果] 结缔组织红色，肌肉、胞质灰绿色，红细胞绿色，核蓝黑色。
4. Clark改良Van Gieson台盼蓝法(1971年)
用于胶原纤维、包括非常细的纤维，以及肌肉角化上皮的染色。
[固定] 甲醛固定液。
[试剂配制]
(l)A液 0.3g萘酚黄S（naphthol yellow S）溶窜犯100mI蒸馏水。
(2)B液 0.2g酸性复红溶于100ml蒸馏水中。
(3)C液 0.2g台盼蓝溶于100ml 蒸馏水中。
染色液由40份A溶液，2.5份B溶液和2份C溶液组成。每40分A溶液加入，0.4ml浓盐酸。
[染色方法]
(1)石蜡切片，脱蜡至水
(2)在Weigert铁苏木素中5ml。
(3)自来水洗。
(4)在染色液中染l0min。
(5)在水中迅速洗一下即经过50%、70%与95%乙醇，无水乙醇两次。
(6)二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果] 核-蓝黑色；胞质-黄色，胶原纤维-粗纤维红色，细纤维蓝色。
[说明] 本法中的Weigert铁苏素液染色，可改用�花青-铬矾溶液中染16 h。
5 . Biebric猩红染色法 Lillie，1965年
[显示目的] 胶原纤维、网状纤维、肌肉、胞质。
[固定] 甲醛液，Orth液。
[试剂配制]
(l)A液 Weigert铁苏木精，见苦味酸酸性复红法。
(2)B液 0.2gBiebrich猩红溶于100ml1%醋酸。
(3)C液 0.1g苯胺蓝溶示100ml饱和苦味酸水溶液。
[染色方法]
(1)常规脱蜡至水。
(2)在A溶液中染5min。
(3)自来水冲洗。
(4)在B染液中染4min。
(5)自来水洗。
(6)在C染液中染5min。
(7)直接移入1%醋酸中3min。
(8)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果] 结缔组织蓝色，肾小球基质蓝色，网状纤维蓝色，红细胞橙红至猩红色，肌肉粉红色，胞质粉红色至灰色，核黑蓝色，粘液浅蓝色。
6. 苦味酸氨基黑染色法 L i1lie，1965年
[显示目的] 胶原纤维、网状纤维、基膜、肾小球基质。
[固定] 任何固定剂均可。
[试剂配制]
(l)A液 煌紫素R(Brilliant purpurin R)0.6g；偶氮复红G(azo-fuchsin G)0.4g；冰醋酸1ml，蒸馏水加至100m1，上述两种染料先各自用1%醋酸配成1%溶液，以6�4比例混合后再用。
(2)B液 氨基黑10B，5~100mg；苦味酸饱和水溶液100m1。同样浓度的苯胺蓝或甲基蓝均可用来代替氨基黑(又称蔡酚蓝黑)，粘液可得到较好的显示。
[染色方法]
(1)切片常规脱蜡至水。
(2)在Weigert铁苏素中染6min。
(3)自来水洗。
(4)在A染液中染5min。
(5)流水中洗。
(6)在B染液中染1~5min。
(7)在1%醋酸中分色2min。
(8)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果] 胶原纤维、网状纤维和基膜深绿色；粘液深绿色，上皮细胞胞质棕色，肌肉浅绿色，红细胞红色。
7. Petersen 酸性茜蓝改良法
[显示目的] 胶原与网状组织、骨铬肌、心肌横纹、心肌间板。
[固定] Zenker液，Helly液、Bouin液或甲醛液。
[试剂配制]
(1)A液 即缓冲的酸性茜蓝溶液。酸性茜蓝2B，0.25g；硫酸铝5g；蒸馏水50m1。煮沸5min。冷却，过滤，再补足到原来的体积。然后加20ml的Sorensen柠檬酸盐溶液(柠檬酸晶体21g，lN NaOH，200m1。加蒸馏水至1000ml)和30ml 0.lN盐酸缓冲到pH为2.25。
(2)B液 即苯胺蓝橘黄G溶液。苯胺蓝0.5g; 橘黄G，2g；蒸馏水100ml，冰醋酸8ml，煮沸，冷却，过滤。
[染色方法]
(1)常规石蜡切片，脱蜡至水。
(2)在A液中染3min。
(3)在蒸馏水中快速洗2次。
(4)在5%磷钨酸液中分色并媒染2~3min。
(5)蒸馏水洗。
(6)在未经稀释的B液中染2~3min。如染色结果太深，可用1、2或3倍体积的蒸馏水稀释。
(7)蒸馏水中略洗。
(8)先用95%乙醇后用无水乙醇脱水。
(9)二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果] 胶原与网状结缔组织蓝色，染色质砖红色，肌组织根据所用不同品种的固定剂染色从深品红色至亮橙色，红细胞橙红色，粘液淡蓝色，神经节细胞淡品红色，腺细饱根据其组成从浅蓝色至品红色。
8. 显示胶原纤维、细胞和肌肉的新染法
[固定]中性甲醛液，石蜡切片。
[试剂配制]
(1)Ponceau's染色液 0.5%Pohceau's(丽春红S，上海试剂三厂)水溶液l0~15ml，苦味酸饱和水溶液85~90ml。
(2)Victoria blue'B 染色液 Victoria blue'B(维多利亚蓝，B，上海试剂三厂) 0.5 g， 70%乙醇100m1。
[染色方法]
(1)组织切片脱蜡至水。
(2)70%乙醇稍洗后，入Victoria blue'B染色液中l5min。
(3)95%乙醇中分化数秒钟。
(4)用蒸馏水洗2次。
(5)用Ponceau's染色液滴染2min。
(6)直接用无水乙醇分化与脱水。
(7)二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果]胶原纤维呈鲜红色，细胞核和血细胞呈绿色，肌肉呈黄色。