新技术大大提高细胞成像技术敏感性

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SCFP3A的结构特征

自20世纪90年代初伊始，荧光蛋白就成为了生物科学领域最重要的研究工具之一，近日来自法国让•皮埃尔•埃贝尔结构生物学研究所 的Antoine Royant研究小组和来自荷兰及英国的科学家展开了合作，设计出了一种新型的荧光蛋白分子，新荧光分子可在活细胞中发射亮度高3倍的蓝绿色光，大大提高了细胞成像技术的敏感性，从而可以帮助实现更高分辨率的活体内生物过程成像。这一研究成果发表在3月20日的《自然通讯》（Nature Communications）杂志上。

科学家们通常将CFPs连接到参与内部或构象改变的蛋白质上，借以观测或细胞内大量的生物进程。研究人员利用蓝光照射细胞使细胞内的CFP蛋白发射出特征性的蓝绿色光从而帮助定位细胞内CFP，确定观察目标。然而这些分子 长期都存在的一种缺陷就是荧光水平太弱，仅有36%的蓝光转换为了蓝绿色光。

为了获得更高的亮度，提高荧光成像的敏感度，来自法国让•皮埃尔•埃贝尔结构生物学研究所 的Antoine Royant研究小组和来自荷兰及英国的科学家展开了合作。

首先来自法国和英国牛津大学的科学家利用欧洲同步辐射装置(ESRF)的高亮X-射线束，揭示了CFPs如何存储进入能量及以荧光形式再传送能量的精微细节：他们生成了大量不同的改良CFPs的微小晶体，解析了它们的分子 结构。借助于这些结构研究人员揭示出了邻近CFP发光复合物——发色团 (chromophore)的精细机制。“我们了解了CFPs内单个原子的功能，并能精确地指出需要修饰或提高荧光量的分子部分，”ESRF的David von Stetten说。

与此同时，由荷兰科学家Theodorus Gadella领导的研究小组也利用创新的筛查技术研究了数百种修饰的CFP分子 ，对这些分子在显微镜下的荧光寿命进行了测量以寻找可提高这些性能的因素。

通过合理的设计，最终科学家们获得了一种称之为mTurquoise2.的新型CFP分子。结构生物学和细胞生物学的研究结果显示mTurquoise2的荧光效率达到了93%。利用这种新型的分子，科学家们可以前所未有的灵敏度研究活细胞内的蛋白质互作。

“有了这种新型蛋白，现在可以从前未能获得的精细度开展大量研究。此外，由于新方法还将蛋白质的结构动力纳入了其中，使得科学家们满怀希望能够设计出更多发射不同颜色荧光的改良蛋白来用于其他的应用，”Antoine Royant说。

青色荧光蛋白（CFPs）被广泛应用于细胞生物学中，自20世纪90年代初伊始，荧光蛋白就成为了生物科学领域最重要的研究工具之一，帮助观察从前无法看到生物过程，例如大脑中神经细胞的发育、癌细胞的扩散等。2008年的诺贝尔化学奖授予了发现和推广这一技术的科学家。此次研发出来的新型的分子，可以使科学家以前所未有的灵敏度研究活细胞内的蛋白质互作，进一步推动了青色荧光蛋白的应用技术。（生物帮bio1000.com）

原文摘要：

Structure-guided evolution of cyan fluorescent proteins towards a quantum yield of 93%

Cyan variants of green fluorescent protein are widely used as donors in Förster resonance energy transfer experiments. The popular, but modestly bright, Enhanced Cyan Fluorescent Protein (ECFP) was sequentially improved into the brighter variants Super Cyan Fluorescent Protein 3A (SCFP3A) and mTurquoise, the latter exhibiting a high-fluorescence quantum yield and a long mono-exponential fluorescence lifetime. Here we combine X-ray crystallography and excited-state calculations to rationalize these stepwise improvements. The enhancement originates from stabilization of the seventh β-strand and the strengthening of the sole chromophore-stabilizing hydrogen bond. The structural analysis highlighted one suboptimal internal residue, which was subjected to saturation mutagenesis combined with fluorescence lifetime-based screening. This resulted in mTurquoise2, a brighter variant with faster maturation, high photostability, longer mono-exponential lifetime and the highest quantum yield measured for a monomeric fluorescent protein. Together, these properties make mTurquoise2 the preferable cyan variant of green fluorescent protein for long-term imaging and as donor for Förster resonance energy transfer to a yellow fluorescent protein.