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植物组织培养再生的步骤

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一、接种

组织培养的接种是指将灭过菌的材料,在无菌的情况下,切成小块,放入培养基的过程。科研、生产部门的接种工作,多在无菌室或超净工作台上进行,中学可制作接种箱,在箱内进行接种。接种的方法步骤如下:

1、在无菌室或接种箱中放好接种时所需要的酒精灯、贮存70%酒精和棉球的广口瓶、各种镊子、接种针、解剖刀、手术剪、火柴、培养基等。

2、在无菌室或接种箱内用紫外灯灭菌(无菌室照射20~50分钟,接种箱照射15分钟)。

3、放入已灭菌的接种材料(用培养皿盛取)。同时,操作人员用酒精棉球擦手,并对接种工具用酒精灯火焰烧灼。

4、用手术刀片将材料切割成若干片段,并迅速接种入培养基中。接种时,锥形瓶(或试管)应斜向火焰,在酒精灯火焰附近操作。

5、材料接种好后,将锥形瓶瓶口在酒精灯火焰上转动烧一遍,盖好瓶盖,注明材料名称及接种日期。

材料接种后,应置于26~28℃的培养室中进行培养。

二、植株诱导

本阶段是组织培养中最重要的一环。在培养基中植物 激素的作用下,外植体通过三条途径迅速增殖,这就是侧芽增殖、诱导不定芽的形成和诱导胚状体的形成。

1、侧芽增殖

种子植物 的每个叶腋中通常都存在着腋芽,在一定条件下可以使它生长。现在知道顶端优势抑制侧芽生长,可被外源的细胞分裂素打破,所以在利用侧芽增殖这条途径时,培养基中几乎都要加入细胞分裂素(有时也加入少量生长素)。由于细胞分裂素的持续作用,侧芽不断分化和生长,逐渐形成芽丛。如果反复切割和转移到新的培养基上继代培养,就可在短期内得到大量的芽。 侧芽增殖的主要优点是能保持遗传的稳定性,因为茎尖的细胞常是均一的二倍体细胞,它不易受培养条件的影响而发生变异,也易于保持嵌合体的性状。目前已有近百种植物可以用这种方法进行繁殖,如草毒(Fragaria ananassa Duch.)、苹果、葡萄(Vitis vinifera L.)、唐菖蒲(Gladiolus gandavensis Houtt.)、非洲菊、月季(Rosa chinensis Jacq.)、甜菜(Beta vulgaris L.)和凤梨(Ananas comosus(L.) Merr.)等。 关于培养基中加入细胞分裂素的浓度,是0.1~10.0毫克/升,一般为1.0~2.0毫克/升。在几种细胞分裂素中用的最多的是6-苄基嘌呤,其次是激动素和异戎基腺苷,玉米素用的很少。 除了细胞分裂素之外,在培养基中还经常加入低浓度的生长素以促进腋芽的生长。常用的生长素是萘乙酸、吲哚丁酸和吲哚乙酸(浓度为0.1~1.0毫克/升)。

2、不定芽的诱导形成

在自然条件下,很多种植物 的器官可以产生不定芽。在培养条件下,由于所需要的外植体很小又加上激素的作用,可以使这种产生不定芽的能力得到极好的发挥,如秋海棠或非洲紫罗兰(Saintpaulia ionantha Wendl.)用常规的叶插法繁殖时,每片叶只能产生几个到十几个芽,但用叶切段在培养基中可产生成千上万个芽。在培养条件下,还能使自然条件下不产生不定芽的器官形成不定芽,如卷心菜(Brassica oleracea L.var.capi-tata L.)和番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)的叶、菊花[Dendranthema morifolium(Ram.) Tzvel.]的花和叶片、百合(Lilium brownii F.E.Br.var.viridulum Baker)和水仙的鳞片以及萱草(Hemerocallis fulva L.)的花茎等。 在诱导外植体形成不定芽时,一般使用细胞分裂素高于生长素比值的激素配比,少数情况下也采用二者比值接近1的配比。常用的细胞分裂素是6-苄基嘌呤,激动素和玉米素,浓度范围一般在0.1~10.0毫克/升。生长素是萘乙酸、吲哚乙酸和吲哚丁酸,其浓度范围与细胞分裂素相同。为了使外植体形成不定芽,外源激素的供应只是一个方面,器官分化的性质还要决定于内源激素的状况。因此,对于不同的植物,使用的激素种类和浓度常有较大的变化。在具体操作时,应参考已有资料或相近种类的已有结果,以确定适当的浓度和配比。

3、胚状体的诱导形成

在自然界只有少数植物 可以由珠心产生胚状体。在培养条件下,现在已有30多个科的150多种植物可以产生胚状体。在诱导胚状体的形成时,其外植体一般取自胚、分生组织或生殖器官。为了获得胚状体,在培养过程中,培养基中应含有丰富的还原氮,并加入生长素(主要是2,4-D)诱导胚状体的发生。待胚状体发生后,要转移到降低浓度或没有生长素的培养基上进行培养,使胚状体成熟和生长。

胚状体途径的优点是增殖率高,而且胚状体既具胚芽又具胚根。因此,可免去生根这一步骤。但目前很多重要作物还不能形成胚状体,或产生的胚状体难以形成植株,另外胚状体遗传性也容易发生变异,所以目前除柑桔(Citrus)、油棕(Elaeis guine-ensis Jacq.)和咖啡(Coffea)等少数作物外,都不采用这一途径。

三、生根

生根是获得完整植株的一个关键。通过侧芽和不定芽途径产生的芽长成嫩枝后(此时的嫩枝叫试管苗),必须诱导生根才能移植。促使试管苗生根的方法通常有两种。一种是在固体培养基上诱导生根。当试管苗长到2~3厘米高时,将它从基部切下,转移到只含0.2~0.5毫克/升的萘乙酸或吲哚丁酸的固体培养基上生根。另一种是浸泡的方法,将切下的无根试管苗泡在含有高浓度生长素溶液中,生长素浓度为100毫克/升左右,浸泡时间从几小时到1天,然后取出接种于不加任何激素的MS培养基上,十天左右即可生根。

以上两种方法,在更换培养基后,经过几天,都要将试管苗的瓶口打开,上盖1~2层纱布,以便于通气。并要适当加强光照,以增加试管苗的自养能力。

四、移栽

当试管苗的根原基突起或形成几毫米长的短根时,将其取出,洗去琼脂 ,载入有少量营养的人工基质中。移栽后,保持高湿度,避免阳光直射和过大的温度波动,经过一段逐步锻炼的过程,再定植到土壤中。

在移栽过程中,试管苗的环境条件发生了剧烈的变化,其本身又从异养变到自养,叶的光合作用和根的吸收作用需要逐渐发展。因此移栽时要小心控制,使试管苗逐步锻炼,最终能在土壤中生活。

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