有机沉淀法总蛋白提取实用小教程
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- 从植物叶片提取的植物总蛋白不但是家养类动物生长发育的重要营养物质，而且是具有潜力的新一代营养保健食品，因而掌握植物叶蛋白的提取方法至关重要，让我们一起了解这整个实验原理和过程吧。
一、实验目的
熟悉植物叶蛋白的几种提取原理和方法，了解其意义及其应用价值。
二、实验原理
植物叶蛋白或称绿色蛋白浓缩物(leaf protein concentration，简称LPC)，是从新鲜植物叶片中提取的高质量浓缩蛋白质，不仅是畜禽生长发育和生产畜产品的主要营养物质，而且目前也正成为人类的保健营养理想食品之一。天然蛋白存在于为数甚多的植物体内，对其分离应依据人们的利用目的及提取蛋白含量和品质加以考虑。
天然蛋白质一般在溶液中呈稳定的亲水胶体状态，故LPC 亦称叶蛋白胶。其特点是：
(1)水化作用 即蛋白质分子表面附有能有效防止蛋白质分子沉淀析出的水化膜;
(2)电荷排斥作用 水化膜外还有电荷层(具阴、阳离子)能有效地防止蛋白质分子的凝集。故溶液蛋白质颗粒(溶质)呈溶解状态;
(3)欲提取植物组织中的蛋白质必须利用溶解度的差异进行分离纯化(如盐析、有机溶剂分级沉淀法、疏水层析、结晶、加热、离心分离等法)，利用分子大小和形状差异进行分离纯化(分子筛层析法);还可利用电荷性质的差异分离纯化(离子交换法)。只要创造上述影响因素，即可使蛋白质从植物叶片中分离并沉淀出来。
植物叶蛋白提取一般遵循如下基本原则：尽可能提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失;减少对蛋白质的人为修饰;破坏蛋白与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。根据该原则，植物叶蛋白制备过程中一般需要有四种试剂
①离液剂：尿素和硫脲等;
②表面活性剂：又称去垢剂，早期常用NP-40、Tritonx-100等非离子型去垢剂，离子型去垢剂有SDS、胆酸钠、LiDS 等，还有象CHAPS(含它的蛋白溶液可以冻存)与Zwittergent 等双性离子去垢剂;
③还原剂：DTT、DTE、TBP、Tris-base 等;
④蛋白酶抑制剂及核酸酶：EDTA、PMSF、蛋白酶抑制剂混合物(Protease inhibitor cocktails)等，如为了去除缓冲液中存在的痕量重金属离子，可在其中加入0.1～5 mmol/LEDTA，同时使金属蛋白酶失活。
三、仪器和试剂
仪器
离心机、移液器、研钵、离心管、冰箱。
试剂
1. 20 mL 样品提取缓冲液：2.5 mL 0.5 mol/LTris-HCl
3. -20 ℃下预冷丙酮(含0.07% β-巯基乙醇)
4. -20 ℃预冷的80%丙酮(含0.07% β-巯基乙醇)
5. 饱和硫酸铵溶液 称取(NH4)2SO4 80 g，加蒸馏水100 mL，加热50～60 ℃，搅拌溶解，室温过夜，用浓氨水调pH 至7.0
6. 0.05 molpH7.0的磷酸缓冲液10%NaCl 0.1mol 醋酸95%乙醇
7. 植物叶片(草本植物、木本植物叶片等都可)
四、实验步骤
植物叶蛋白的提取主要有盐析法、有机溶剂沉淀法、加热法(含逐步和快速加热)、 离心分离法、结晶和重结晶法等。依据今后的开发方向(以饲料为基础，以食品、饮品为开发方向)及简便易行和使用的原则，主要采用盐析法、加热法和有机溶剂法分离提取叶蛋白(冷提和热提)。不同的提取方法，对样品的处理方式、程度和要求不同，结果也有差异。
1. (NH4)2SO4 沉淀法提取叶蛋白
取0.3 g 植物叶蛋白，用液氮充分研磨转入离心管中，加入3 mL 提取缓冲液，摇匀并放在4 ℃条件下提取1 h，充分溶解蛋白后，4 ℃10000 r/min 离心20 min，弃沉淀，上清液中加入(NH4)2SO4，混匀1 h，按1：2(v/v)加入-20 ℃预冷的80%丙酮，混匀后4 ℃12000 r/min 离心10 min，沉淀在-20 ℃冰箱中放置20 min，使丙酮完全挥发后加适量上样缓冲液，待沉淀充分溶解后，4 ℃12000 r/min 离心5 min，取上清液即为所提取的叶蛋白溶液。
2. 改良丙酮沉淀法提取叶蛋白
取0.3 g 左右的植物叶片，用液氮研磨，色素多的可按材料鲜重的10%加入PVP，并将充分研磨过的样品转入离心管中，加入4 mL 的提取缓冲液，摇匀并放在4 ℃条件下提取1 h，充分溶解蛋白。放置后的样品充分摇匀，4 ℃10000 r/min 离心30min，弃沉淀，上清液中加入2.5～3倍体积的村-20 ℃条件下过夜，让蛋白充分沉淀。之后，4 ℃10000 r/min 离心30min，其上清，沉淀置于-20 ℃下，使丙酮完全挥发，如有必要加入上样缓冲液溶解沉淀。缓冲液用量300 ul，沉淀充分溶解后，转移至1.5 mL 离心管中，4 ℃12000 r/min 离心15min ，取上清液即为所提取的叶蛋白溶液。
该方法提取的蛋白质，提取效率高，杂质干扰少，电泳结果蛋白条带清晰，数量多。
3. 植物叶片总蛋白的提取—三氯醋酸—丙酮沉淀法
①在液氮中研磨适量的叶片;
②悬浮于含10%的三氯醋酸和含0.07% β-巯基乙醇(可用DTT 代替)的丙酮溶液在-20 ℃条件下冰浴;
③让蛋白质沉淀过夜后离心(4 ℃ 10000 r/min 离心30~60min)，弃上清;
④重悬沉淀浮于含0.07% β-巯基乙醇的预冷丙酮溶液中;
⑤离心(同上)后真空干燥沉淀;
⑥用上样缓冲液溶解沉淀，离心;
⑦Brandford 法定量蛋白，然后分装至Eppendof 管中保存在-78 ℃备用。
4. 分步提取可溶性叶蛋白
(1)蛋白质浸出
①水溶性蛋白质浸出：用0.05 molpH7.0的磷酸缓冲液(或蒸馏水)将样品制成匀浆液，然后离心15min(4000 r/min)，收集上清液即蛋白质浸出液，再将沉淀物按上述操作重复两次。
②盐溶性蛋白质浸出用10%NaCl 将前者剩余沉淀物分离提取两次，收集蛋白质浸出液。
(2)蛋白质沉淀用0.1mol 醋酸将蛋白质浸出液pH 值调至蛋白质等电点(pH4.5左右)，即8体积蛋白质浸出液加入1体积0.1 mol 醋酸，混匀，离心15min(3000 r/min)，弃去上清液，沉淀物即为可溶性叶蛋白。
(3)蛋白质收集于沉淀物中加入95%乙醇，混匀，用定量滤纸过滤或抽滤，待风干后收集。
植物总蛋白的提取方法以有机盐沉淀法为主，本文中介绍到的(NH4)2SO4沉淀法、丙酮沉淀法、三氯乙酸—丙酮沉淀法和分步提取法，各个方法各有特点和适用范围，各位如有更好的植物总蛋白提取方法，欢迎补充。
