七 质粒DNA的制备
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1.了解质粒的特性及其在分子 生物学研究中的作用；
2.掌握质粒 DNA分离和纯化的原理；
3.学习碱裂解法 和煮沸法分离质粒DNA的方法。
质粒是细菌内的共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞特定的表型。质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组 克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA 序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单个酶切位点；（3）能插入较大的外源DNA 片段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb 至10kb 之间，如pBR322、pUC 系列、pGEM 系列和pBluescript（简称pBS）等。经过改造的基因工程质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介，这种基因的运载工具在基因工程中具有极广泛的用途，而质粒的分离与提取则是基因工程最常用、最基本的实验技术。
一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法和羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株的类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途选择不同的方法。本实验介绍最常用的碱裂解法和煮沸法提取质粒DNA。
1. 碱变性法
碱变性法提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性和复性的差异而达到分离的目的。在pH值高达12.6的碱性环境中，染色体的线性DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而被变性；共价闭环质粒DNA的大部分氢键也断裂，但两条互补链不会完全分离，仍会紧密地结合在一起。用pH4.8的KAc或NaAc高盐缓冲液调节其pH值到中性时，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此可以迅速复性；而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能复性，它们相互缠绕形成不溶性网状物，而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，用酚-氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA，然后用乙醇或异丙醇将溶于上清液中的质粒DNA沉淀。
2.煮沸法
细胞用含有TritonX－100的缓冲液处理，溶解细胞膜。用溶菌酶酶解细菌细胞，然后在高温条件下，使细胞裂解，破坏细菌细胞壁，有助于解开DNA链的碱基对，并使蛋白质和染色体DNA变性。而闭环质粒DNA配对虽被破坏，但双链彼此不分开，当温度下降时恢复成超螺旋。变性蛋白带着染色体DNA一起沉淀下来，质粒DNA仍留在上清液中。离心后的上清液再用异丙醇或乙醇处理，沉淀出质粒DNA。
以上两种制备方法的实验过程中，由于细菌裂解后受到剪切力或核酸降解酶的作用，染色体DNA容易被切断成为各种大小不同的碎片而与质粒DNA共同存在，因此，采用乙醇沉淀法得到的DNA除含有质粒DNA外，还可能有少部分染色体DNA和RNA，必要时可进一步纯化。
提取的质粒DNA中会含有RNA，但RNA一般并不干扰进一步实验，如限制性内切酶消化，亚克隆及连接反应等，因此不必除去。
（一）菌种和培养基
1.大肠杆菌DH5α（含质粒pT-GFP，该质粒为T载体联上了绿色荧光蛋白GFP基因的重组质粒）。
2.LB液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800mL去离子水中，用NaOH调pH至7.2，加去离子水至总体积1L。分装于150 mL三角瓶中，每瓶50 mL，置高压蒸气锅以1.034×105Pa，121℃灭菌20分钟。
3.氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：用无菌水配成 10 mg/mL水溶液，过滤除菌，分装成小份存于灭菌有盖离心管中，-20℃保存备用，不宜反复冻溶。
（二）试剂
1.溶液I：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)，10mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌15min，储存于4℃冰箱。
2.溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH（临用前用10mol/L NaOH母液稀释），1％ SDS（从10% SDS母液中稀释，SDS母液可室温保存），现配现用。
3.溶液III：5 mol/L KAc 60mL，冰醋酸11.5mL，H2O 28.5mL，高压灭菌，4℃冰箱保存。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。
4.3 mol/L 醋酸钠 (pH5.2)：800 mL水中溶解408.1g NaAc•3H2O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100mL，分装后高压灭菌，储存于4℃冰箱。
5.STE缓冲液：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris•Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。
6.STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris•Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)， 5% Triton
X-100。
7.TE缓冲液：10 mmo/L Tris•Cl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。
8.RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L Tris•Cl(pH7.5)，15mmol/L NaCl中，配成10mg/mL的溶液，于100℃加热15min，使残留的DNA酶失活。冷却后用1.5mL Eppendorf管分装成小份保存于-20℃。
9.溶菌酶（10mg/ml）：用10mmol/L Tris.Cl, PH8.0, 新鲜配制。
10.TE饱和酚（1）
11.酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1)：
12.氯仿：异戊醇（24:1）：按氯仿:异戊醇＝24:1体积比加入异戊醇（2）。氯仿可使蛋白变性并有助于水相与有机相的分开，异戊醇则可消除抽提过程中出现的泡沫。
13.电泳所用试剂： （1） TBE 缓冲液 (5×)：称取 Tris 54g，硼酸27.5g，并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20mL，定溶至1000mL。 （2）上样缓冲液 (6×)：0.25% 溴酚蓝，40% (w/v) 蔗糖水溶液。
14.异丙醇
15.70％乙醇
（二）设备
超净工作台，微量取液器(20μL, 200μL, 1000μL)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。
（一）小量制备
碱变性法：
1.将含有质粒pGFPuv 的DH5α菌种划线接种在LB固体培养基（含有100 μg/mL Amp）（3）上，37℃培养12-24小时（4）。用无菌牙签挑取单菌落接种到5mL LB液体培养基(含有100 μg/mL Amp)中，37℃振荡培养14~16小时。
2.取1.5 mL培养液加入1.5 mL 离心管中，室温12, 000 r/min离心1分钟收集菌体(视菌体量多少，可重复此步)。
3.加入100 μL预冷的溶液Ⅰ涡旋振荡悬浮菌体（5）。
4.加入新配制的溶液Ⅱ200μL，轻缓上下颠倒离心5次，至溶液澄清(千万不要振荡)，冰浴5分钟（6）。
5.立即加入用冰预冷的150μL溶液III，轻柔振荡5~10次（7），冰浴5分钟（8），12, 000 r/min离心5min。
6.取上清移入干净Eppendorf管中，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1)，剧烈振荡20秒。室温下12,000 r/min离心10分钟，可见溶液分三层，上层为质粒DNA溶液，中层为变性的蛋白层，下层为有机相。
7.取上清（6），加入400μL氯仿:异戊醇(24:1)，剧烈振荡20秒。12,000r/min 离心10分钟。（选做）
8.取上清，加入2~2.5倍体积无水乙醇振荡混匀，沉淀DNA，-20℃放置10min（7）。（或者加1倍异丙醇，室温静置10min），12,000rpm 离心10分钟。
9.去上清，加入200μL 70%乙醇（8），12000g，2分钟。洗涤沉淀两次以去盐。
10.将Eppendorf管倒置于一张纸巾上，使液体流出，然后短暂离心，用移液器小心取出残液，这一步操作要格外小心，有时沉淀块贴壁不紧，放离心管于超净工作台蒸发痕迹乙醇。（除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴）。
11.将沉淀溶于30μL TE缓冲液(pH8.0，含20μg /mL RNaseA)中（9），储于-20℃冰箱中。如直接酶切，可将沉淀溶于30~50μL ddH2O（含20μg /mL RNaseA）。
12.利用比色法测定质粒DNA在260 nm和280 nm下的光吸收值并计算样品浓度。
13.用1%琼脂糖凝胶电泳观察质粒DNA的纯度和条带情况。
煮沸法
1.取1.5ml 培养菌体（1）置于离心管中,10000ｇ离心1分钟。
2.弃上清（2），将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3.将菌体沉淀悬浮于350ul STET 溶液中, 涡旋混匀。
4.加入25ul 新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml) （3）, 涡旋振荡3 秒钟混匀。（溶菌酶溶液PH值不能低于8.0，否则溶菌酶就不能有效发挥作用。）
5.将离心管放入沸水浴中,时间恰为40秒，12000g，离心10分钟。
6.吸出上清移至另一个离心管，或直接用消毒牙签取出沉淀物，在上清中加入40ul 5mol/L NaAc（PH5.2）和420ul 异丙醇，振荡混匀，室温放置5分钟。
7.12000g，4℃离心5分钟，将Eppendorf管倒置于一张纸巾上，使液体流出，然后短暂离心，用移液器小心取出残液，这一步操作要格外小心，有时沉淀块贴壁不紧，放离心管于超净工作台蒸发痕迹乙醇或室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体（2－5）分钟。
8.弃上清， 加入1ml70％乙醇，12000g，4℃离心2分钟。按步骤7回收核酸沉淀。
9.加入50ul TE（PH8.0）（含无DNA酶的RNA酶 20ug/ml），溶解DNA，稍加振荡，储存于－20℃。
（二）大量制备
碱变性法：
1.从平板上挑选一个单菌落，接种到50mL培养基，37℃过夜培养14~16小时。
2.将培养物转入50mL离心管，4,800r/min 4℃离心10分钟。
3.沉淀用10mL STE洗涤，涡旋打匀， 4,800r/min 4℃离心10分钟。
4.加入3mL溶液I，涡旋，冰浴5分钟。
5.加入6mL溶液Ⅱ(现配)，轻柔颠倒数次直至溶液澄清，保持冰浴5分钟。
6.马上加入溶液Ⅲ 4.5mL，轻柔颠倒5~10次，得到白色沉淀，冰浴3－5分钟。
7.4,800r/min 4℃离心20分钟，取上清，加入0.6倍体积异丙醇，室温放置10分钟，沉淀DNA。
8.4,800r/min室温离心 10分钟，去上清，加入75%乙醇，洗涤沉淀。
9.4,800r/min离心 10分钟，去上清，吸出痕量剩余乙醇，风干。
10.加入1.5mL TE溶液，溶解沉淀，转入7mL离心管。
11.加入等体积5mol/L LiCl (预冷)，颠倒混匀，冰浴10分钟，沉淀大分子RNA。
12.10,000r/min 4℃ 离心10分钟，取上清，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟。
13.10,000r/min 室温离心10分钟，室温放置20~30分钟。用700μl含无ＤＮＡ酶的胰ＲＮＡ酶(20μg/ml ）的ＴＥ（pH8.0）溶解沉淀
14.转移至1.5mL离心管，加入等体积13% PEG8000/1.6mol/L NaCl，混匀，冰浴10分钟，沉淀双螺旋质粒DNA。
15.12,000r/min离心10分钟，去上清，加入1mL 75%乙醇，洗涤沉淀。
16.12,000r/min离心10分钟，去上清，吸出痕量剩余乙醇，风干。
17.加入600μL TE溶液溶解沉淀。
18.酚、酚：氯仿：异戊醇、氯仿：异戊醇各抽提一次，去除蛋白。
19.将上清转移至另一离心管，加入1/10体积3M NaAc，2倍体积无水乙醇，4℃沉淀10分钟。
20.12,000r/min 离心10分钟，去上清，加入1mL 75%乙醇，洗涤沉淀。
21.12,000r/min 离心10分钟，去上清，吸出痕量剩余乙醇，风干。
22.加入200μL ddH2O，溶解质粒。
（三）聚乙二醇沉淀法质粒ＤＮＡ
这里介绍的方法（R.Tresman,个人通讯）已卓有成效地用于纯化碱裂解法制备的质粒ＤＮＡ。
１）将核酸溶液[上页步骤22）所得]转入15mlＣorex 管中， 再加3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀，用Ｓorvall SS34 转头（或与其相当的转头）于４℃下以10 000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子ＲＮＡ。
２）将上清转移到另一30mlCorex管内，加等量的异丙醇， 充分混匀，用SorvallSS34转头（或与其相当的转尖）于室温以10 000转/分离心10分钏， 回收沉淀的核酸。
３）小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70％乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管侄置，在纸巾上放置几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。
４）用500μl含无ＤＮＡ酶的胰ＲＮＡ酶(20μg/ml ）的ＴＥ（pH8.0）溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中，于室温放置30分钟。
５）加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量离心机于４℃以12000g离心５分钟，以回收质粒ＤＮＡ。
６）吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解质粒ＤＮＡ沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽１次。
７）将水相转到另一微量离心管中，加100μl 10mol/L乙醇铵，充分混匀，加２倍体积（约1ml）乙醇，于室温放置10分钟，于４℃以12 000g离心５分钟，以回收沉淀的质粒ＤＮＡ。
８）吸去上清，加200μl处于４℃以12 000g离心２分钟。
９）吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。
10）用500μlＴＥ（pH8.0）溶解沉淀1:100稀释[用ＴＥ（pH8.0)] 后测量ＯＤ260，计算质粒ＤＮＡ的浓度（１ＯＤ260＝50μg质粒ＤＮＡ/ml）， 然后将ＤＮＡ贮于－20℃。
（一）小量制备
1. 碱变性法注意事项
（1）市售酚中含有醌等氧化物，这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联，应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羟基喹啉 (作为抗氧化剂)，并用等体积的0.5mol/L Tris•Cl (pH8.0)和0.1mol/L Tris•Cl(pH8.0) 缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上，因为酸性条件下DNA会分配于有机相。
（2）氯仿可使蛋白变性并有助于水相与有机相的分开，异戊醇则可消除抽提过程中出现的泡沫。
（3）培养时应加入筛选压力（抗生素），否则菌体易污染，质粒易丢失；
（4）使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加），细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时；
（5）溶液I中各成分的作用：葡萄糖的作用是分散细胞，EDTA是Ca和Mg等二价金属离子的螯合剂，其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性。
（6）溶液Ⅱ加入后5min内快速用溶液III中和，防止共价闭和环状质粒DNA在强碱环境中暴露时间过长发生不可逆的变性，质粒易被打断；溶液II中各成分的作用：NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的变化；但NaOH易和空气中的CO2发生反应形成NaCO3，降低了NaOH的碱性，所以必须用新鲜的NaOH。SDS与NaOH联用，其目的是为了增强NaOH的强碱性，同时SDS能很好地结合蛋白，产生沉淀。
（7）加入溶液II 和III后不要剧烈振荡，防止可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中；
（8）复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染；
（9）酚:氯仿:异戊醇抽提后，应小心吸取含质粒DNA的上清溶液，防止吸到位于有机相和水相之间的变性的蛋白质，约可吸到420μL；
（10）使用冰乙醇沉淀DNA，并在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀更完全。
（11）沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等；
（12）TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性，pH值为8.0，可防止DNA发生酸解；
（13）溶液III 中各成分的作用：溶液III 中的KAC是为了使钾离子置换 SDS 中的纳离子而形成了 PDS，因为十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 （potassium dodecylsulfate,PDS），而 PDS 是不溶水的，同时一个 SDS 分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。2 M 的醋酸是为了中和 NaOH，因为长时间的碱性条件会打断 DNA，所以要中和。基因组 DNA 一旦发生断裂，就不能再被 PDS 共沉淀了，所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。75%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase；
得到的质粒样品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带即超螺旋、线性和开环这三条带。
2. 煮沸法注意事项
（1）从表达内切核酸酶Ａ的大肠杆菌株（endA+株，如HB101 ）制备质粒时，建议不使用煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶Ａ，以后在Mg2+存在下温育时，质粒DNA可被降解。 用70％乙醇洗涤一步前增加用酚：氯仿进行抽提步骤，可避免此问题。
（2）的细菌沉淀和核酸沉淀中去除上清液时，一定要除尽。否则质粒DNA不能被限制酶 切割。
（3）添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。
（二）聚乙二醇沉淀法质粒ＤＮＡ常见问题及可能原因
1.提取的质粒DNA不纯：变性不充分；关键步骤反应时间过短；离心时间或速度不够。
2.提取的质粒DNA呈涂布状：操作过程中用力过猛，动作过大；操作系统内有污染。
3.与染色体DNA分离不全：变性过程不完全；试剂配制有问题（成分，浓度或pH）。
1.第一天：
上午：配制所需的各种试剂及培养基，装好枪头、离心管、牙签等耗材，并在高温下灭菌。
下午：接种摇菌
2.第二天：
上午：收取培养物，提取质粒DNA
下午：比色和电泳检测DNA的浓度和纯度以备酶切
1.提交质粒DNA的浓度结果及电泳检测图谱
2.质粒的基本性质有哪些？
3.碱法提取DNA的过程中溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ生化作用原理分别是什么？
4.在碱法提取质粒DNA操作过程中应注意哪些问题？
提质粒流程图：
