简单扩增体系中引物设计原则

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引物在PCR 反应中处于关键作用，引物决定着扩增的特异性和扩增的效率。而在目前DNA的化学合成技术非常成熟的情形下，引物设计 是否合适是我们应更为关注的层面。现在有很多的免费的软件 或网络资源(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)能辅助我们进行引物设计 ，这使我们总能找到适合我们自己应用的引物设计工具。笔者用得较多的引物设计软件 有oligo 6.0，Primer premier 5。需要说明的是经过细致推敲和计算的引物并不能保证扩增一定能够成功或高效，但严密的设计并系统地考虑一些应该避免的问题，能使我们在大多数情形下找到我们所需要的引物。 笔者接触PCR 较早，较多地从事引物设计也有一年多的时间，其间也得到过许多老师的帮助指教，现将一些体会整理出来，希望能对大家有一些帮助，同时也盼望能得到更多的指点。

简单扩增体系中引物设计原则：

简单体系，是指扩增体系中模板较为单一且大部或全部模板序列已知，如经过纯化的短片段或纯化后的重组 质粒 等，是相对后面所提的复杂体系而言的一个粗略的分类。以下是一个大致的流程：

1， 考虑实验本身对这对引物的要求。如：待扩增区域和扩增产物长度，扩增产物是否需要考虑移码突变 ，是否需要在引物5’端引入酶切位点和引入哪些酶切位点，是否需要引入点突变 ，…… 依据具体的实验而定。实际上，此步应该是最费时间和精力的一步。

2， 引物的Tm值。主要需要考虑的因素有：I, 反应体系对引物退火温度 的影响;如酶的最适工作温度对引物退火温度 的限制等。II,扩增产物的Tm值。引物和产物的Tm值不要相差太大，20摄氏度范围内较好。定下引物的Tm值范围之后即可定下引物的长度范围。

3， 引物的二级结构。包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。对于3’末端且5’端突出的引物二聚体，应控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物中间或5’端可适当放宽。发卡结构也以3’端或近3’端对引物-模板结合影响更大，影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构亦有很大的关系。应尽量避免3’末端有发卡结构的引物。

4， 扩增的特异性。好的设计工具会提供一个引物异位引发的评价指标，如Oligo 6.0 的false priming efficiency，即异位引发效率，这个值是由程序根据引物自身二级结构的能量、错配的类型、错配离3'末端的距离等因素综合计算而得出，当此值大于200时便很有可能引发扩增。如所用工具无量化指标，则可依据经验，当引物与模板在非预期位置退火，超过70%的碱基能互补配对，或引物3’末端连续8个或以上碱基配对，则认为有引发的可能。

在简单扩增体系中，当我们定好上述限制条件，如能找到适合这些条件的引物，便最大可能地找到适合我们实验的引物。如不能满足上述所有条件，则按所列顺序依次满足，总的来说遵循这样一个秩序：扩增出符合实验需要的产物→扩增出能够分辨分离的符合实验需要的产物→特异地扩增出符合实验需要的产物。同样，这一先后秩序也适用于复杂的扩增体系。