植物基因中的大肠杆菌原核表达方法

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通过大肠杆菌表达目的基因大量获得重组 蛋白是一个方便快捷的方法。植物中克隆的目的基因被克隆到特异设计的质粒载体上，受噬菌体T7强启动子控制;表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。当需要表达蛋白时，在细菌培养基中加入IPTG来启动表达。不同载体在邻近克隆位点处具有编码不同的多肽“标签”的序列，在定位、检测或纯化目的蛋白时提供方便。

以pET-32a(+)为例，介绍将目的基因克隆进载体并进行表达获得重组 蛋白的过程，从而熟悉根据自己的要求采用不同的载体进行原核表达的全过程。

1.准备工作(试剂配置和器材准备)

1)操作流程示意图

主要步骤操作

①制备pET-32a(+)载体 用限制性酶消化，去磷酸化后胶纯化回收

②制备插入DNA PCR 装入质粒后进行限制性消化，再回收

③插入片段克隆到pET-32a(+)载体 插入片段与pET连接，转化

④转化表达宿主菌BL21 转化带有T7RNA聚合酶基因的菌株

⑤诱导表达目的蛋白 SDS-PAGE，Western 印迹、定量分析确定目的蛋白

⑥放大试验纯化目的蛋白 放大试验，制备粗提物，亲和纯化，切除融合标签

2)配制生长培养基如LB，和100mM IPTG,50μg/ml 卡那霉素存储液。

3)宿主菌的保存。长期存放菌株和pET重组子应保存于甘油中。

4)感受态细胞的制备，参照其它试验手册。

2.操作步骤

[1] 制备载体

1)载体消化和胶纯化

3μg pET载体

3μl 10×限制性内切酶buffer

10-20U 两种酶(是否共用buffer; 酶体积不要超过反应体系的10%)

3μl 1mg/ml乙酰BSA(根据需要

补足水到30μl

2)37℃温浴2-4h

3)取3μl样品进行电泳检测消化反应进行的程度

4)消化完全后，加入0.05U小牛碱性磷酸酶，37℃ 30min

5)全部样品在1%琼脂糖胶上电泳，切带按照胶回收试剂盒说明回收目标片段。

6)-20℃保存备用。

[2]制备插入片段

限制性消化和胶纯化是制备插入片段的常规方法。一般先用PCR扩增带酶切位点的目标基因，克隆进T-载体，然后用与消化载体相同的内切酶进行消化和胶回收。但在PCR过程中，需要减少突变的发生，可采用高保真酶，尽量减少PCR循环次数，增加模板和引物的浓度。

[3]在pET32a载体中插入片段

连接反应

2μl 10×连接buffer

2-5μl 50ng/μl 预制的pET32a载体

1μl T4连接酶

5-7μl 预制目标基因插入片段

加水到20μl，枪头混匀，16℃反应2h-过夜

[4]转化

转化方法同T-载体转化大肠杆菌DH5α一样，既可转化BL21也可转化DH5α，若转化DH5α，需要重新抽提质粒，再转化BL21。筛选LB平板需含50μg/μl 卡那霉素。

[5]pET重组子鉴定

如果亚克隆成功，阳性菌落数远大于阴性菌落。检验转化子的方法很多，包括PCR、质粒抽提及酶切分析、测序，体外转录和翻译。

[6]DE3溶原菌的诱导表达

(1)、从新鲜的划线平板中挑取单克隆到50ml含50μg/μl 卡那霉素的液体培养基中，37℃培养至OD600为0.4-1。

(2)、培养基中加入100mMIPTG至终浓度为0.4mM(T7启动子)或1 mM(T7lac启动子)，继续培养2-3小时。

(3)、将摇瓶置于冰上5min，5000g 4℃离心5min收集菌体。

(4)、重悬细胞于0.25倍体积预冷的20mMTris-HCl (pH8.0)中，离心。

(5)、除去上清，菌体保存于-70℃或继续纯化。

[7]SDS-PAGE进行目标蛋白质分析

(1)、机械破碎细胞。一般用弗氏压碎法或超声波处理。

(2)、裂解液14000g离心10min，分离可溶和不溶部分。

(3)100μl可溶上清中加入100μl 4×SDS上样buffer和水。85℃迅速加热3min使蛋白变性，然后上样进行SDS-PAGE分析，观察蛋白表达。

(4)若目标蛋白在不溶部分中，需进行包涵体纯化。750μl20mMTris-HCl,pH7.5重悬沉淀，离心10000g5min,除去上清重复洗涤。然后1.5ml 1%SDS上样buffer中重悬沉淀，重复(3)的步骤进行SDS-PAGE分析。

3.总结(注意事项)

(1)所有操作尽量在冰上操作，以避免蛋白质发生变性;

(2)根据自己的需要选择不同的表达载体，并注意不同的表达载体上的融合标签和携带的抗性基因，其中有些标签是可以去除的。

(3)构建好的载体最好进行测序验证，保证读码框正确，即没有移码。

(4)长期保存的pET重组子在高浓度甘油(19%)中会导致质粒不稳定。

(5)T7lac启动子是严谨启动子，IPTG诱导时可以优化最佳浓度(25uM-1mM之间)使目的蛋白达到最佳的活性和溶解性。

(6)37℃生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体，而30℃生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白。在某些情况下，低温(15-20℃)延长诱导时间(过夜)可以使溶解性蛋白的产量达到最大。

(7)进行SDS-PAGE分析时，需优化电泳上样体积。