几种基因操作的工具酶

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重组DNA技术工具酶

一、 限制性核酸内切酶及其应用

(一)限制性核酸内切酶的发现

当λ(k)噬菌体侵染E.coli B时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。 Eco核酸酶不能识别已甲基化的序列。

最早分离出的限制内切酶是在1968年，Meselson和Yuan，大肠杆菌 B和K菌株，EcoB和EcoK， 是I型的，没有实用价值。

首个II型限制内切酶是在1970年，由H.O.Smith等从Heamophilus influenzae的Rd菌株中Hind II 。使得DNA分子 的体外精确切割成为可能。

从此，相关研究展开。如NEB公司的提取和克隆。目前已纯化出3000种限制性内切酶 中，其中有30%是在NEB发现的 。

限制性核酸内切酶(restriction endonuclease )：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸 序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3，5-磷酸二酯键。

(二)限制性核酸内切酶的分类

分为I型、II型和III型。

(三)限制性核酸内切酶的命名

1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体

字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichia coli 表示为Eco , 流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示为Hin;

2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind;

3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则用罗马数字标出，比如Eco R I、 Hin。d III

(四) II型限制性核酸内切酶的基本特性

1、识别位点的特异性

每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4～8个核苷酸组成的特定序列(靶序列)。

2、识别序列的对称性

靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。

3、切割位点的规范性

交错切或对称切(可形成粘性末端或平末端的DNA分子)。

与II型核酸内切酶有关的几个概念

粘性末端：cohesive ends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。

平 末 端 ：Blunt end在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端结构。则不易于重新环化。

同裂酶：isoschizomers 能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同来源的内切酶。不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别。

同尾酶：isocaudamers 识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。如BamH I 、BclI、BglII和Xho I 是一组同尾酶。

注 意： 由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。

(五)限制性核酸内切酶的消化反应

一个限制酶单位(U)指：在理想的反应条件(适宜的缓冲液和反应温度，通常为37℃)下，1h内中完全降解1 mg l DNA所需要的酶量。

影响酶活性的因素很多，最重要的有：

⑴　DNA的纯度

⑵　 DNA的甲基化程度

⑶　酶切反应的温度(通常为37℃ )

⑷　DNA的分子结构

⑸　 核酸内切限制酶的缓冲液

在“非最适的”反应条件下,有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子，这种现象叫星号活性。用表示。

二、 DNA连接酶及其应用

(一)DNA连接酶的发现

环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种切口的酶存在。

首个DNA连接酶(ligase)——大肠杆菌DNA连接酶，是1967年发现的，是大肠杆菌基因编码。

1970年，发现了T4DNA连接酶，由大肠杆菌T4噬菌体基因编码的。

(二) DNA连接酶作用特点

1. 连接的两条链必须分别具有自由3’-OH和5’-P，而且这两个基团彼此相邻;

2. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。

E.coli DNA连接酶 -连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明)，现在研究可连接平末端;需NAD+辅助因子，活性低，不常用。

T 4DNA连接酶-连接具互补碱基黏性末端和平末端，需ATP辅助因子，活性高，常用。

(三) DNA连接酶的反应条件

影响连接效率的因素有：

1. 温度(通常在4-15℃ )

2. ATP的浓度(10μM/L - 1mM/L )

3. 连接酶浓度(一般平末端大约需1～2U，黏性末端仅需0.1U)

4. 反应时间(通常连接过夜)

5. 插入片段和载体片段的摩尔比( 1∶1～5∶1)

(四)T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案

1.连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。

2.10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子(一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1～5∶1)，补足ddH2O 至8μl。

3.轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴5min后，迅速转入冰浴。

4.加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位， 用ddH2O 补至10μl，稍加离心，在适当温度(一般14-16℃)连接8-14hr。

三、DNA聚合酶及其应用

(一)大肠杆菌DNA聚合酶I

是Kornberg A. 1956年首先从大肠杆菌E。Coli 细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括 3种不同的酶活力：

5′→ 3′聚合酶活性(模板， 带3′-OH游离基团的引物、4dNTPs、 Mg2+ )。

双链特异性的5'→3'核酸外切酶活性。

3'→5'核酸外切酶活性。

从游离的双链或单链DNA的3′端降解。不过对于双链的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。主要是校正作用。

大肠杆菌DNA聚合酶I 的三种用途

1.利用缺口转移法制备高比活度的DNA探针

利用其5′--3′的外切酶活性及其聚合酶活性。

2.用于DNA连接前的大缺口填充

利用5′--3′的聚合酶活性。

3.用于DNA的序列分析

利用5′--3′的聚合酶活性。

(二)Klenow片段酶

Klenow片段是大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，分子量为76KD 。

酶催活性：⑴5’ →3’ 的聚合酶活性

⑵3’ →5’ 的核酸外切酶活性

Klenow片段的主要用途(利用5’ →3’ 的聚合酶活性)：

⑴修补限制性酶消化DNA形成的3′隐蔽末端

⑵标记DNA片段的末端

底物用[α-32P]-dNTPs

⑶cDNA克隆中第二链cDNA的合成

⑷DNA序列的测定

(三)T4 DNA聚合酶

T4DNA聚合酶是从T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，

1.酶催活性：

⑴5′→3′的聚合酶活性

⑵3 ′→ 5 ′的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶 I 的活性高200倍。比Klenow 片段酶强100～1,000倍。

因此，可以综合利用这两种活性进行取代合成反应：

如果反应体系中仅存在一种dNTP或没有底物时，这时T4DNA聚合酶就会表现出3 ′→ 5 ′外切酶活力，从双链DNA的3′开始降解，直到露出底物dNTP相同的碱基。然后就在此位置发生合成和取代反应。

2.T4DNA聚合酶的用途

(1)利用取代合成反应制备探针

(2)标记具有平末端的或具有3’-隐蔽末端的DNA片段

利用较强的3 ′→ 5 ′外切酶活性和 5′→3′聚合活性

(3)用于DNA序列分析

(四)逆转录酶(反转录酶)

逆转录酶 是一种依赖RNA的DNA聚合酶。

此酶首先是1970年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的。这两个课题组的论文都发在了同一期的《Nature》杂志上。

最普遍使用的是从鸟类骨髓母细胞瘤病毒(AMV)分离出来的。

活性：一种可以有效地将mRNA反转录成DNA的酶，其产物称为cDNA(complementary DNA).

主要用途是 将mRNA转录成cDNA以制备基因片段。

四、修饰性工具酶

(一)末端转移酶(terminal transferase)

l 末端转移酶是一类不依赖于DNA模板的DNA聚合酶。

l 特性：该类酶可以在没有模板链存在的情况下，将核苷酸连接到dsDNA或ssDNA的在3’-OH。特别是对于平末端的双链DNA末端加尾十分有用。

l 最常见的用途：给外源DNA片段及载体分子加上互补的同聚物尾巴，以创造黏性末端，便于重组。

(二) SI核酸酶(SI nuclease)

这是一种从米曲霉(Aspergillus oryzae)中分离的高度单链特异的外切酶。

活性：可以降解单链DNA或RNA或双链的单链区。

其主要用途有：

⑴　在cDNA合成过程中，切开cDNA的发夹末端;

⑵　载体构建过程中，切去DNA片段的单链尾巴，

形成平末端结构。

(三)碱性磷酸酶

从大肠杆菌中分离的细菌碱性磷酸酶(Bacterial Alkaline Phosphatase)简称BAP。

从小牛肠中分离的叫小牛肠碱性磷酸酶( Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) ，简称CIP，用的广泛。

酶催功能：

脱磷酸作用，将单链或双链DNA或RNA5’-P转化成5’-OH。

其主要用途有：

⑴在用32P标记DNA 5′端之前，去除5′端的磷;

⑵在DNA重组技术中，去除DNA片段的5′磷酸，防止载体的自身环化，提高重组子比例。