如何理解DNA连接酶的作用特点

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重组DNA技术工具酶

1、如何理解DNA连接 酶的作用特点?

教科书的观点：DNA连接 酶无特异性，其催化DNA片段末端连接的情况分两种：(1)催化相同或互补的黏性末端连接;(2)催化同一种限制酶切割产生的平末端连接。两种情况下，末端的“拼接”都会形成“回文序列”。

然而，在基因工程的实际操作中，催化DNA片段末端连接的方法是非常灵活的。例如，当目的序列和载体 上没有相同的限制性内切酶位点可供利用时，而用不同的限制性内切酶切割后的黏性末端不能互补结合，则可用适当的酶将DNA突出的末端削平或补齐成平末端，再用T4DNA连接酶连接，但平末端连接要比黏性末端连接的效率低得多。 由此可见，DNA连接酶可以催化两种不同限制酶切割产生的平末端连接，而两个平末端拼接后，并不是“回文序列”。

结论：DNA连接酶催化两个末端连接形成的新序列并不都是“回文序列”。(注：回文序列——双链DNA分子中一段旋转对称的核苷酸序列，即以对称轴为轴心旋转180°后呈对称状态，它是大多数限制性内切酶 的识别位点。《中国百科大辞典》)

2、如何理解“双酶切”策略下基因表达载体 的构建和筛选?

在构建基因表达载体时，最简单的重组方式就是在目的基因DNA的两端用两种不同的限制性酶进行酶切，产生两个不同的黏性末端。再用这两种限制酶对合适的载体进行酶切，也产生两个不同的粘性末端。酶切后的目的基因和载体，由于它们各自的两个末端不同，都不会发生自身环化。然后在DNA连接酶的催化下，目的基因片段只能从一个方向插入载体中(同一种限制酶切割产生的相同黏性末端才可以连接)，重组的效率较高，也易于筛选出重组子。