DNA酶切与回收方法及问题解析

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基因工程实验中目的基因与载体 经过PCR扩增后都要进行回收以后才能进行后续工作，而胶回收的目的基因与载体的浓度高低，对后续的链接起到至关重要的作用，因此DNA回收是基因工程中比较重要的步骤，文中即介绍一种从凝胶中回收DNA的操作步骤及胶回收过程中可能遇到的问题。

一、酶切

1、原理

限制性内切酶 是分子操作中重要的工具酶，是一类能够识别双链DNA分子某种特定的核苷酸序列并切割双链DNA分子的核酸内切酶。可分为3类，Ⅰ和Ⅲ类限制酶兼有甲基化等修饰作用及以来ATP的限制性切割活性，前者结合于识别位点随即切割DNA，后者则在识别位点切割。Ⅱ类限制酶是由两种酶分子组成的复合体系，一种具有限制性内切酶功能，切割某一特定的核苷酸序列，另一种为独立的甲基化酶，可修饰同一识别序列。

绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4-7个核苷酸 且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异，切割DNA后，有的产生平末端，有的产生粘性末端。应用限制酶：

(1)可提供DNA物理图谱 的特异性标记;

(2)酶切产生的特异性片段可用于分子 克隆;

DNA分子经限制性内切酶消化以后，产生不同大小的DNA片段，我们需要从中分离出所需的目的片段，进一步做亚克隆或用作探针。通过琼脂糖凝胶电泳可以将目的片段与其它DNA片段分开，然后从琼脂糖凝胶中回收含有相应片段的液体，经酚/氯仿处理、乙醇沉淀就可以获得符合要求的DNA片段。

2、酶切反应体系：

按下表配制酶解混合液，混匀，37℃ 保温2-4小时，加入上样缓冲液终止反应，或-20℃保存。

10X缓冲液：10μL

质粒DNA(pRSETA)：20μL

BamHI：3μL

HindⅢ：2μL

H2O：65μL

二、从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA片段操作步骤

1、将已经电泳确定的可回收的酶切产物在合适浓度的回收用琼脂糖凝胶进行电泳。最好换用新的电泳缓冲液10 × TAE(10 ×Tris-乙酸)。

2、当溴酚蓝迁移至足够距离时(至少2 cm以上)，在长波紫外灯下观察，用清洗过的刀片在目的片段前切下与目的片段同长，宽度适当(一般2 cm左右)的胶块。

注意：

①不要忘记在胶下垫一个新的塑料手套防止污染。

②小心不要将回收胶切裂，同时注意与目的带相邻的切面要尽量平整。

3、将切好的回收胶块放在回收胶槽内，在切去胶块处加入低熔点琼脂糖胶，待其凝固后将其小心放回电泳槽继续进行电泳。小心低熔点琼脂糖凝胶块与原回收胶块的交界面易断裂。

4、待目的带完全进入低熔点琼脂糖胶后，在长波紫外灯下用清洗过的刀片切下含有所需DNA带的凝胶条，置于新的灭菌的1.5 mL Eppendorf管中，加300 µL TE。

5、65℃水浴10 min或更长使胶块完全融化。

6、立即加入等体积(300~350 µL)Tris-Cl饱和酚(pH 8.0)，摇晃混匀。

7、12000 rpm离心5 min。

8、小心将水相移到另一1.5 mL Eppendorf管中，加入2.5~3倍体积(780 µL即可)预冷无水乙醇。注意不要吸入下层杂质及酚相，没把握时宁可放弃一些上层水相。

9、12000 rpm离心5 min。

10、小心将水相移到另一1.5 mL Eppendorf管中，加入2.5~3倍体积(780 µL即可)预冷无水乙醇。注意不要吸入下层杂质及酚相，没把握时宁可放弃一些上层水相

11、置液氮3 min，取出后可置于-20℃放几min。小心防止管子爆裂。

12、12000 rpm离心10 min。

13、迅速弃上清，一般在管底会有针尖大小的沉淀物，小心用无水乙醇清洗后置于恒温器上干燥(55℃)5~10 min至无乙醇气味，再加入20 µL ddH2O溶解。

14、取20 µL电泳定量后-20℃储存备用。

三、DNA胶回收中常见问题分析

1、如何计算提取率?

1) 回收前样品中，往往含有非目的DNA 片段、引物、dNTP 等，所以不能用测回收前后吸光度的的方法计算回收率;

2) 可将回收前后DNA 片段一起电泳，使用凝胶成像系统拍照后，用配套的软件进行电泳条带灰度对比;

3) 注意，电泳条件及拍摄条件将对灰度对比结果造成很大影响，请仔细操作，以减小误差。

2、如何简易测算提取率?

取胶回收后的DNA溶液体积的1/5—1/10，与等体积的回收前的DNA溶液的5—10倍稀释液一起电泳，肉眼观察回收后的条带相对于回收前条带的亮度，粗略测算回收率(如亮度只有一半时，其回收率可粗略为50%)。

3、如何看待提取得率?

影响回收率的因素很多，如DNA片段大小、点样量、凝胶种类、电泳缓冲液的缓冲能力、切胶操作、紫外灯照射强度和时间、溶胶是否彻底等等，所以不能单凭1-2次的实验来判断其质量好坏，最好是多做几次实验或用几种不同品牌的产品做平行对照实验，结果相对真实。

4、回收率为什么与点样量和片段大小有关?

DNA片断越大，和固相基质的结合力越强，就越难洗脱，回收率就低;DNA的量越少，相对损失越大，回收率越低。

5、用胶回收试剂盒从凝胶中回收DNA得率低是什么原因?

1) 胶块溶解不完全，可适当延长水浴时间和上下颠倒的次数以及增加溶胶液的比例;

2) 胶块体积太大，应使用枪头捣碎，还不能充分溶解则先将其切为小块，分多次回收;

3) 紫外灯下切胶时间过长，导致DNA部分降解，应尽量把切胶时间控制在30s以内;

4) 洗涤液使用后未及时盖严瓶盖，乙醇挥发，影响回收效率;

5) TAE或TBE电泳缓冲液不新鲜，失去了缓冲能力，导致PH值升高，降低DNA和膜的吸附力，应及时更换电泳缓冲液，最好使用新鲜配制的电泳缓冲液，效果更好。

6) 回收前的样品量太少，加大点样量

7) 洗脱前，预先65℃预热洗脱液、延长室温静置时间、增加洗脱次数可以有效提高回收率30%以上。

6、加入溶胶液温浴后，液体仍很粘稠或后续步骤有堵柱子现象?

1) 胶块溶解不充分，可再补加一些溶胶液或延长水浴时间并增加上下颠倒次数帮助溶胶;

2) 胶块体积过大，应尽量切除多余部分，并将其切为小碎块，分几次回收;

3) 水浴温度是否达到规定温度65℃，用温度计检测。

7、琼脂糖凝胶块不溶?

1) 琼脂糖质量不好;

2) 含目的片断的凝胶在空气中放置过久，使胶块失水干躁，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存于4 ℃或-20℃;

3) 制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。

8、点样时发现DNA样品有漂出点样孔外的现象?

柱子上的乙醇未完全挥发干净，延长室温下空柱静置时间以确保乙醇完全挥发干净。

9、能否使用去离子水洗脱回收?

可以，但是实验室所用去离子水一般PH值偏低，可用NaOH适当调高PH值>7.0，以增加回收得率。

10、能否使用TE(PH8.0)洗脱?

可以

11、可否使用小于30μl的洗脱液进行洗脱?

不可以。因为说明书提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积。

12、关于DNA片段大小与回收率的问题?

100bp-500bp，30-60%;500bp-4kb，80-95%;4kb以上，30-50%。

13、OD值与琼脂糖凝胶中的DNA产量不相符?

从柱子上洗脱下来的痕量杂质增加了A260的值

14、吸光度纯度测定时应注意的问题

吸光度测量的是未知样品与调零标准之间的相对吸光度，所以请用与洗脱液体相同的液体，对测量样品进行稀释和调零。

15、为什么溶胶不彻底会影响回收结果的纯度?

在电泳过程中，DNA凝胶的密度和质量不同，DNA分子与凝胶的结合力也不一样，因此DNA分子与凝胶中多糖结合的紧密度也有差异。由于只有在琼脂糖凝胶完全溶解的情况下DNA分子藏能充分释放出来，凝胶溶解不完全，DNA分子就会与凝胶仪器沉淀下去，使最终回收的DNA浓度降低。