酶切体系中不可忽视的13个实验要素

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本文展示了建立一个标准的酶切体系需要注意的13个要素，例如怎么去选择正确的酶，DNA甲基化问题，缓冲液，反应体积，反应时间和温度，终止反应，对照反应，稳定性，贮存条件等等。

一、 建立一个标准的酶切反应

目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间;如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间(不超过16小时)也可完全反应。

二、 选择正确的酶

不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44(256)个碱基中切割一次;而一个识别6个碱基的酶将平均在每46(4096)碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的(3''或5''突出端)，也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。相关信息参见目录的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文。

三、 酶

内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中(在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合)。酶的用量视在底物上的切割频率而定。例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。参见目录第244和264之"切割质粒 DNA"和"包埋法切割DNA"。

四、 DNA

待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA 、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。

五、 缓冲液

对于每一种酶NEB都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。使用时的缓冲液浓度应为1X。有的酶要求100μg/ml的BSA 以实现最佳活性。在这种情况下，我们也相应提供100X的BSA(10mg/ml)。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。关于缓冲液更详细的信息参见第234页。

六、 反应体积

内切酶活力单位的定义是：1小时内，50μl反应体积中，降解1μg的底物DNA所需的酶为一个活力单位。因此酶：DNA的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器 误差的影响。为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10%(一般酶都贮存于50%的甘油中)。

七、 混合

这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应完全，必须使反应液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡!

八、 反应温度

大部分酶的反应温度为37°C;从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。一般为50-65°C不等。参看第244页 Activity of thermophiles at 37°C。

九、 反应时间

1酶活单位的定义时间为1小时。如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间;反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到完全。参见第241页酶在反应中的存活时间。

十、 终止反应

v如果不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应。在NEB我们使用如下反应终止液：50%的甘油，50mM EDTA (pH8.0)，和0.05%溴酚蓝(10μl/50μl反应液)。如果要进行下一步酶切反应，可用热失活法终止反应(65°C或85°C，20分钟)。热失活并不能适用于所有的酶，详情参见第240页热失活表。此外，酚/氯仿抽提也可以用于终止反应。

十一、贮存

大部分酶应贮存于-20°C。少部分酶则须在-70°C长期保存。详情请参见相关酶的DATA SHEET 或目录相关部分。10X BUFFER 和100X BSA于-20°C保存。BSA不能与NEBuffer混合后保存，否则将会出现BSA沉淀。

十二、稳定性

每隔1-2个月都会对所有的酶有一个活性检测;最近的一次检测结果将被贴在售出的每一管酶上。通过三十多年来的经验，我们发现大部分酶在推荐的保存缓冲液里在-20°C条件下十分稳定。高于-20°C条件下稳定性将有所降低。

十三、对照反应

如果发现您的DNA底物不能被成功切开，可以进行对照实验以查明原因。具体方法如下：

将不加内切酶的底物DNA(待切底物)与加入了内切酶的对照DNA(有多个已知酶切位点)同时进行反应。若实验结果表明底物DNA降解，则说明DNA在纯化过程中或反应液里引入了核酸酶污染;若实验结果发现底物DNA保持完整，而对照DNA被成功切开，则可以排除酶质量的原因，此时可以将对照DNA和待切底物DNA混合起来再次进行反应，以确定样品中是否有抑制剂。如果有抑制剂存在(通常是盐、EDTA或酚)，则混合物里的对照DNA也无法被切开。

我们知道，酶切实验在核酸实验中占据重要的位置，而酶切体系的建立对于整个酶切实验的重要性不容忽视。以上是13个酶切体系建立过程中需要注意的因素，如有不足之处，还望各路实验达人多多补充和指教。