16srDNA的提取与检测方法

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最近需要做几个菌的16srDNA PCR ，也用了变性梯度凝胶电泳（DGGE），由于新手初来乍到，请教了几个师兄，现将有关16srDNA的提取以及DGGE检测实验操作步骤总结下。

一 样品总DNA的提取

1 实验器材： 玻璃器材，铝盖，1.5mL离心管，螺口管，锆珠，搅拌器，4℃离心机 。

2 实验试剂： PBS (0.05M，pH=7)，水饱和酚，TE饱和酚，TN150，TE缓冲液，TAE缓冲液，NaAc (pH=5.2),氯仿/异戊醇(24：1)(V/V)，96%冷乙醇，70%冷乙醇。

3 实验操作：

3.1 细胞分裂

称取0.5g样品入含0.3g锆珠、已灭菌的screw-capped tube 中，

加入1mL TN150，和150µL 酸性酚，bead-beater匀浆(5000rpm,3min),冰上冷却，

加入150µL氯仿/异戊醇，涡旋混匀，

10000rpm离心，5min

转移上清液至已灭菌的eppendorf 管

3.2 DNA提取

加入150µL氯仿/异戊醇，和150µLTE饱和酚至上述eppendorf管中

涡旋混匀1min，

10000rpm离心1min，

上清移入灭菌的eppendorf管中，

重复上述步骤直至水相之间的界面清晰为止，

上清移入灭菌的eppendorf管中，

加入300µL氯仿/异戊醇，10000rpm离心1min，

上清移入灭菌的eppendorf管中，

加入96%冷乙醇1mL，和50µL3M NaAc (pH=5.2),

-20℃沉淀DNA过夜。

10000rpm离心20min

弃上清，

加入500µL70%冷乙醇溶解沉淀，

10000rpm离心5min

弃上清。风干沉淀

加入50µLTE缓冲液溶解DNA

-20℃保存提取的DNA

4实验注意事项：

酚是致癌物质，实验操作应配带手套，且不要将该溶液洒在桌面上或地面上。实验中使用了挥发性有毒物质，操作应在通风橱中进行。

实验过程中样品应放置冰面上，所有离心操作在4℃下进行。

二、DNA的检测—琼脂糖凝胶电泳

1试剂和器材： 电泳缓冲液(undefinedTAE)，溴乙锭(EB)染色贮存液(1mg/mL),0.25%溴酚兰，琼脂糖，双蒸水。

电泳仪，水平电泳槽，透射紫外灯，胶带纸。

2 实验操作

2.1 1.2%琼脂糖凝胶的制备：

◇用胶带纸将洗净、干燥的电泳凝胶床的两端开口封好，形成一个胶模，水平放在工作台的位置上，插入样品梳，与底面相距0.5-1mm。

◇称1.2g琼脂糖置于小锥形瓶中，加入100mL undefinedTAE稀释缓冲液，加热直至琼脂糖完全溶解(透明溶化液)。待冷却至60℃戴手套操作：小心加入5µLEB染色贮存液，摇匀。

◇将琼脂糖倒入胶模中，倒胶时要避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。

◇待凝固完全后，双手均匀用力轻轻拔出样品梳。

◇取下封边的胶带纸，移入电泳槽，倒入电泳缓冲液直至浸没凝胶面2-3mm。

2.2点样

用微量加样器或可调枪依次将所提取DNA与加样缓冲液(loading buffer)5:1混合后点入加样孔内。

2.3电泳：

100mv.电泳15-20分钟。

2.4观察：

紫外检测。

3 实验注意事项：

溴化乙锭(EB)是诱变剂，配置和使用时应带手套，且不要将该溶液洒在桌面上或地面上，凡是被其沾污的地方必须专门处理后才可进行清洗和消毒。

加样多少取决于加样槽大小，加入样品体积应略小于加样槽体积。

观测时避免紫外灯对眼睛的伤害。