氯胺酮对新生大鼠认知功能和海马突触素表达的

摘要 目的 观察氯胺酮对新生大鼠认知功能的影响及其机制和对海马突触素的影响。方法 新生1周 Wistar大鼠30只，随机分为三组，每组10只。生理盐水组（N组）给予和氯胺酮同体积生理盐水；K100组和K50组麻醉诱导时分别腹腔注射氯胺酮100mg/kg和50mg/kg，以后每小时追加首剂量的1/2，维持麻醉6h。麻醉后21d进行旷场实验和Morris水迷宫实验，然后取海马标本行突触素免疫组织化学染色，共聚焦显微镜观察并采集图象, Image J 图象处理软件分析荧光半定量OD值。结果 氯胺酮可导致大鼠认知功能降低,海马突触素表达增加（P <0.05）, K100组和K50组之间海马突触素表达差异无显著意义（P＞0.05）。结论氯胺酮可降低新生大鼠认知功能，并上调海马突触素表达。
引言
麻醉药是否影响发育期中枢神经系统的正常发育一直是悬而未决而又具有重要意义的课题。传统观点推断各种麻醉药在体内的短暂作用不会引起神经元及其连接的病理改变，但缺乏实验观察依据。相反，近年许多研究发现在脑发育的关键阶段，动物神经元活性的短暂改变（过度激活或抑制）即可造成神经元形态和功能的异常，影响神经网络的构建。脑爆发生长期应用改变神经元生理活性的N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂可引起不同脑区广泛的凋亡性神经元退行性变。氯胺酮是NMDA受体非竟争性拮抗剂，临床常用于小儿麻醉。麻醉、手术对学习记忆的影响已有研究，但在发育早期氯胺酮麻醉是否对空间辨别性学习记忆有远期影响还鲜见报到。本研究采用神经功能学和免疫组织化学的方法拟观察新生大鼠氯胺酮麻醉后空间辨别学习能力和海马突触素的变化，为麻醉药的合理应用提供实验依据。
1.材料与方法
1.1 动物及麻醉处理 新生1周 Wister大鼠30只，体重18～20g，由西安第四军医大学实验动物中心提供。随机均分为三组，每组10只。生理盐水组（N组）：给予与氯胺酮同体积生理盐水；K100组和K50组麻醉诱导时分别腹腔注射氯胺酮100mg/kg和50mg/kg，以后每小时追加首剂量的1/2，维持麻醉6h。大鼠平卧在自制的麻醉箱中实施麻醉，同时用婴儿脉搏血氧饱和度探头贴于小鼠腹部，监测Sp02和HR，以防止麻醉过深所致大鼠脑缺氧，采集尾部血，用i-STAT型血气分析仪（雅培公司，美国）行血气分析均正常（距幼鼠尾3mm处剪断鼠尾采血）。幼鼠麻醉结束后与母鼠同窝饲养。
1.2 认知功能测试方法
1.21 旷场实验 旷场行为观察箱为60cm×60cm×60cm的无顶木箱, 箱底用墨线分为36个等份小方格。麻醉后3周大鼠自中央格放入，观察在中央格停留时间和2min内穿越的格子数。
1.22 Morris水迷宫实验 水迷宫为一直径1.2ｍ、高0.5ｍ圆桶，划为四个象限，盛水后按0.5%～1.5%比例加入奶粉，使水成不透明乳白色，水温控制于22～25℃。将一直径10cm平台固定于某一象限，平台在水平面下1cm。麻醉后16d开始水迷宫试验。程序包括①定位航行试验历时5d，每天上下午各4次，将大鼠从4个入水点面向池壁放入水中，记录2min内寻找平台的时间(逃避潜伏期)；②空间探索试验，将鼠任选一入水点放入水中，测其2min内在原平台处停留时间。整个认知功能测试过程中，保持实验室内灯光、物品摆放等室内环境一致，以排除环境干扰。
1.3 海马突触素检测方法
1.31动物取材 认知功能测试完毕后立即将大鼠开胸，经左心室至升主动脉插管，先以100ml生理盐水冲洗血液，随后用冷的（4℃）含40g/L多聚甲醛的0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.4）先快后慢灌流固定2h，取脑置于300g/L蔗糖中（4℃）直至组织沉底，冰冻切片机连续冠状切片，片厚30μm，切片分套，置于0.01M PBS中存放。
1.32 免疫染色 取1套切片在0.01M PBS中漂洗后，入含0.3% Triton X-100的0.01M PBS中浸泡30min（室温）。然后进行免疫组织化学荧光染色：加入突触素I抗（1：500，Santa Cruz公司 美国）孵育24h（室温，在湿盒内）。在0.01MPBS液中漂洗3次，每次5min。加入荧光II抗（1：200，Chemicon公司 美国）闭光孵育2h.室温避光孵育2h。0.01 mol/L PBS洗3次，80%甘油封片，Confocal共聚焦显微镜下观察并采集图象, 用Image J 图象处理软件（NIMH公司，美国）进行分析，以荧光半定量OD值来表示突触素的表达水平。
1.4 统计学分析 定量数据以均数±标准差（）表示。采用SPSS10.0统计软件进行多组均数比较的方差分析及均数间的两两比较,用t检验，P≤0.05为差异有显著性统计学意义。
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