HPLC-UV快速检测原奶中的三聚氰胺

 

图1.  低浓度标样线性。

三聚氰胺，简称三胺，分子式C3N6H6，是一种重要的氮杂环有机化工原料。由于三聚氰胺分子中含有大量氮元素，而普通的全氮测定法测奶粉和食品中的蛋白质含量时不能排除这类伪蛋白氮的干扰，因而一些厂商为了降低成本而添加这种化工原料，以提高产品中蛋白质含量。《国际化学品安全手册》第三卷和国际化学品安全卡片说明：长期或反复大量摄入三聚氰胺可能对肾与膀胱产生影响，导致产生结石。近期的“三lu奶粉”事件，就是因为不法分子掺卖混有三聚氰胺的奶粉，导致许多婴儿肾结石，造成了严重的后果。本文采用北京普析通用仪器有限公司的L6-1系列高效液相色谱仪和北京艾杰尔科技的三聚氰胺快速分析方法包，依据GB/T22400-2008《原料乳中三聚氰胺快速检测 液相色谱法》建立原奶中三聚氰胺快速、准确的检测方法。

实验部分

仪器与试剂

仪器：L6-1系列高效液相色谱仪（北京普析通用公司），包括L6-P6二元高压输液泵，L6-UV6可变波长紫外检测器；三聚氰胺快速分析方法包（北京艾杰尔科技有限公司）：包括Venusil M-SCX，5μm，4.6×250mm强阳离子交换柱（科技部“十一五”国家支撑计划成果）及保护柱；针式过滤器（Agela Clarify，0.22/0.45μm，尼龙/MCM）；三聚氰胺标准品（>99%）；空白原奶样品（北京奶牛中心提供）。

 

图2.  高浓度标样线性。

 

试剂：所用乙腈为色谱纯；磷酸二氢钾为分析纯；水为超纯水。

色谱条件

色谱柱：Venusil SCX-M色谱柱（4.6×250mm，5μm，150?）（科技部“十一五”国家支撑计划成果）；流动相：磷酸二氢钾（0.050mol/L）：乙腈=70:30（流动相不需调整pH值）；流速：1.5ml/min；柱温：室温；波长：240nm；实验中若非特别注明，进样量均为20μl。

 

图3.  重复性谱图。

 

试样的制备

称取混合均匀的14.89g原料乳样品（准确至0.01g），置于50ml具塞刻度试管中，加入30ml乙腈，剧烈振荡6min，加水定容至满刻度，充分混匀后静置3min，用一次性注射器吸取上清液用针式过滤器过滤后，作为高效液相色谱分析用试样。

 

图4.  检出限谱图。

 

三聚氰胺标准曲线工作液的配制

■三聚氰胺标准贮备溶液：1.00×103mg/L：称取100mg三聚氰胺标准物质（准确至0.1mg），用水完全溶解后，100ml容量瓶中定容至刻度，混匀。

标准工作溶液

■标准溶液A：2.00×102mg/L：准确移取20.0ml三聚氰胺标准贮备溶液，置于100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，待用。

 

图5.  空白原奶样品测试及重复性。

 

■标准溶液B：0.50mg/L：准确移取0.25ml标准溶液A，置于100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，待用。

■标准工作液的配制

 

表1. 标准工作液配制（高浓度）

 

按表1分别移取不同体积的标准溶液A于容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，0.45μm滤膜过滤，待测。按表2分别移取不同体积的标准溶液B于容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，0.45μm滤膜过滤，待测。

 

表2. 标准工作液配制（低浓度）

 

结果与讨论

线性范围

根据国标要求绘制低浓度和高浓度两条标准曲线：低浓度曲线取0.005mg/L、0.01mg/L、 0.02mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L等5个浓度的标准样品测试，所得标准曲线如图1所示。高浓度曲线取0.2mg/L，0.5mg/L，2mg/L，5mg/L，20mg/L，50mg/L 6个浓度的标准样品测试，所得标准曲线如图2所示。

 

图6.  实际原奶样品添加标品叠加图。

 

由图1、图2可以看出，在国标GB/T22400《原料乳中三聚氰胺快速检测-液相色谱法》所规定范围内，三聚氰胺峰面积和浓度均有良好的线性关系。

重复性

取浓度为5mg/L的标准品溶液，分别进样20μL，进样6次，计算保留时间及峰面积的RSD（相对标准偏差）。结果列于表3中。

 

表3.  保留时间和峰面积的重现性（精密度）

 

从表3和图3看出，该方法结果重复性良好。

检出限

以曲线最低点0.005mg/L的谱图（见图4）为准，以2噪声对应峰高估算检出限为0.0032mg/L，对应原料乳中的三聚氰胺含量为0.011mg/kg。

 

表4.  三聚氰胺样品加标回收率试验结果
 

 

实际样品测试

■空白样品的测定：对同一空白原奶样品平行测定两次，测试谱图如图5所示，表明结果重复性良好。

■实际原奶样品加标回收率：分别在样品中加入相当于0.5mg/L、2mg/L和5mg/L的三聚氰胺标准品，测试谱图如图6所示。

根据此谱图测得三聚氰胺的加标回收率如表4所示，可以看出，本方法检测实际奶样中三聚氰胺高、中、低不同浓度回收率在103.6%~105.2%之间，满足检测要求。同时三聚氰胺能和样品中的相似组分充分分离（分离度按加标浓度由低至高依次为2.724、2.707、2.727），避免了假阳性结果。

结论

通过上述实验结果表明，使用普析通用仪器公司的L6-1系列高效液相色谱仪和艾杰尔科技的三聚氰胺快速分析方法包测定原奶中的三聚氰胺具有检测限低，精密度高，线性范围宽和回收率高等优点，证明了使用国产色谱仪和国产关键耗材，完全可以满足奶制品中三聚氰胺的快速检测要求。
 

(责任编辑：大汉昆仑王)