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耦联到抗体上的荧光团探针

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荧光团探针的选择依赖于下面的重要标准:
A. 仪器。比如,光源,滤片,检测系统。
B. 多标记中对探针色彩区分程度的要求。例如,若丹明红-X (RRX)和德克萨斯红(TR)荧光素的区别就比四甲基若丹明(TRITC)或者Cy3的区别明显。
C. 要求的灵敏度。比如,Cy3和Cy5就比其他的荧光团探针要亮。
Aminomethylcoumarin Acetate (AMCA)
耦联的AMCA吸收光波长最大为350nm,发荧光则为450nm。对于荧光显微镜来说,AMCA可以用汞灯来激发,用紫外滤板来观察。由于AMCA的信号相对较弱,单标实验中不推荐使用AMCA。AMCA和荧光素的荧光波长只有很小的重叠范围,而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠,因此它最常用于多标记实验中,比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。由于人眼不能很好的检测蓝色荧光,在多标记的实验中,AMCA耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。AMCA和荧光素一样很快淬灭,使用抗淬灭剂可以减轻。如果使用在流式细胞仪中,AMCA可以用汞灯或者水冷却的氩光灯激发,因为它们发出的光线是在光谱的紫外区。
Fluorescein Isothiocyanate (FITC)
耦联的荧光素基团吸收的最大波长为492nm,发射的最大波长为520nm。由于FITC被使用了很长时间而且产量很大,FITC被广泛应用。荧光素的最大缺点是淬灭快,因此要和抗淬灭剂一起使用。DTAF是荧光素的一个衍生物,激发和发射波长均和FITC相同。当和链霉亲合素耦联时,因为荧光强度上有明显的区别,最好不使用FITC,而使用DTAF。
Cyanine dyes Cy2, Cy3, Cy5)
Cy2 耦联基团激发波长为492nm,发光为波长510nm的绿色可见光。Cy2和FITC使用相同的滤波片。由于Cy2比FITC在光下更稳定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂,因为这种抗淬灭剂和Cy2反应,在染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。
Cy3Cy5 比其他的荧光团探针要更亮,更稳定,背景更弱。Cy3耦联基团激发光的最大波长为550nm,最强发射光为570nm。因为激发光和发射光波长很接近TRITC, 在荧光显微镜中,可使用和TRITC一样的滤波片。
Cy3 在氩光灯(514nm或528nm)下可以被激发出50%的光强,在氦氖灯(543nm)或者汞灯(546nm)下则约75%。Cy3可以和荧光素一起作双标。Cy3还可以和Cy5一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。
Cy5 耦联基团的激发波长最大650nm,发光波长最大670nm。在氪氩灯(647nm)下它们可被激发出98%的荧光,在氦氖灯下(633nm)为63%。Cy5可以和很多其他的荧光基团一起用在多标记的实验中。由于它的最大发射波长在670nm,Cy5很难用裸眼观察,而且不能用汞灯作理想的激发。通常观察Cy5时采用具有合适激发光和远红外检测器的共聚焦显微镜。在水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。使用传统的表面荧光显微镜时,不推荐使用Cy5。
Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate TRITC)
Rhodamine Red-X (RRX), Texas Red (TR)
这些若丹明的衍生物耦联基团具有不同的吸收波长 (550, 570, 596nm)和最大发射波长(570, 590, 620nm)。尽管TRITC经常和FITC一起在双标记实验中使用,使用RRX和TR可以得到更好的颜色区分。在使用装有氪氩灯的激光共聚焦扫描显微镜作三标记的实验时,RRX尤其有用,可以和Cy2(或者FITC)和Cy5一起使用,因为RRX的发射波长在Cy2和Cy5中间,而且和这两者覆盖都很少。氪氩灯激发光为488nm,598nm和647nm,分别是Cy2(FITC), RRX和Cy5的理想激发波长。因为FITC和PE可以被氩灯的488nm波长激发, 在流式细胞仪中用FITC作双标,另一种用藻红蛋白(PE)耦联基团要比若丹明好,。
亲和层析纯化的抗HRP及其耦联物的抗体可以用来检测HRP,或者放大含有HRP试剂的效果。哺乳动物细胞的免疫染色中,由于抗HRP的抗体不识别内源性的过氧化物酶的类似酶,因此这个抗体的优势就是可以降低背景。
(责任编辑:大汉昆仑王)
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