基金项目:本课题受国家“九五”重点攻关课题（96-960A-01-20）和黑龙江省重点攻关课题（G00C190401）资助
【摘要】 目的 研究多方面比较无血清培养基AIMV与完全培养基对体外细胞因子激活的NK细胞的支持作用。方法 分别用AIMV及完全培养基培养粘附NK细胞（A-NK）和非粘附NK细胞（NA-NK），比较细胞的增殖能力、杀伤肿瘤细胞的能力、表达粘附分子CD11 c 的能力，并通过电镜对A-NK细胞所杀伤的肿瘤细胞进行形态学观察。结果 与完全培养基培养细胞相比，AIMV培养细胞增殖能力、杀伤肿瘤细胞的能力、表达CD11 c 的能力与之相当;在同一培养条件下A-NK细胞的增殖能力、杀伤活性及表达CD11 c 的能力明显强于NA-NK细胞;被A-NK细胞杀伤的肿瘤细胞死亡形式是溶解坏死和凋亡。结论 无血清培养基可替代完全培养基用于A-NK细胞的培养;A-NK细胞用于治疗肿瘤的过继免疫疗法要优于NA-NK细胞。
关键词 粘附NK细胞 无血清培养基 细胞培养 四甲基偶氮唑盐比色法
The culturing of IL-2-activated natural killer cells were
suported with serum-free medium AIMV in vitro
Wang Zhihua，Zhang Yan，Zhang Chunyan
Cancer Research Institute，Harbin Medical University，Harbin150040.
【Abstract】 Objective To compare serum-free medium AIMV with standard serum-containing medium in culturing IL-2-activated natural killer cells in vitro.Methods Proliferation，cytotoxicity in vitro and expression of CD11 c of the cells cultured in the two different media were compared.To observe the tumor target cells killed by adˉherent natural killer cells（A-NK）through electroscope.Results Cells cultured in serum-free medium AIMV could proliferate，kill target cellsand express CD11 c well enough to substitute the cells cultured in standard serum-containing medium.Proliferation，cytotoxicity and expression of CD11 c of A-NK were better than nonadherent natural killer cells（NA-NK）.Death patterns of tumor target cells were necrosis and apoptosis.Conclusion These data indiˉcate that serum-free medium AIMV could replace standard serum-containing medium in culturing IL-2-activated natural killer cells in vitro，and A-NK was the better cells than NA-NK in adoptive immunotherapy.
Key words adherent natural killer cell serum-free medium cell culture MTT-assay
NK细胞是表型和功能上的异质性群体，根据在22nM（6000IU/ml）IL-2诱导下3～5h迅速粘附到塑料表面的能力，可将NK细胞分为两种不同的亚群:粘附NK细胞（adˉherent natural killer cell，A-NK）和非粘附NK细胞（nonadherˉent natural killer cell，NA-NK）。A-NK细胞代表外周血淋巴细胞的一小部分（4%～30%），由于其体外增殖和抗肿瘤能力强，对正常细胞无杀伤作用等优点，成为近年来肿瘤过继免疫疗法的研究热点。现在临床上常用于细胞培养的完全培养基，因含有人AB血清，虽经各种病毒的检测，但仍有可能传播其他疾病，而无血清培养基则可达到生物洁净要求，克服了添加人AB血清的缺点，对于免疫治疗的临床推广应用有重要意义。本研究力求找到一种新的方法，发展无血清培养基用于A-NK细胞的临床生物治疗，即不减少A-NK细胞的数量和活性，又能增加其临床应用的安全性。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与材料 rhIL-2为南京军区军事医学研究所产品;淋巴细胞分离液、苯丙胺酸甲酯（PME）、四甲基偶氮唑盐（MTT）为Sigma公司产品;PE标记的鼠抗人CD11 c 为美国Becton-Dickinson公司产品;RPMI1640培养液及无血清培养液AIMV为美国Gibco公司产品;人AB血清由哈尔滨市红十字中心血站提供，用于人A-NK细胞培养;胎牛血清为美国Hyclone公司产品，用于肿瘤细胞培养;人肺腺癌细胞Anip973和人红白血病细胞K562由本研究所建株传代。所用塑料培养瓶和培养板均为美国Costar公司产品，培养条件为37℃、5%CO 2 饱和湿化空气的培养箱中建立培养。酶标仪为BioRAU，450型，美国制造。
1.2 人外周血单个核细胞的制备 淋巴细胞分离液常规分离健康人的外周血单个核细胞，充分洗涤后，置于塑料离心管中用PME（5mmol/L）室温处理40min后充分洗涤备用。
1.3 A-NK细胞的诱导 用PME处理后的人外周血单个核细胞分别用完全培养基（RPMI1640，含10%人AB血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素）和无血清培养基AIMV在塑料培养瓶内培养，每组加rhIL-2（6000IU/ml）并调整细胞浓度为5×10 6 /ml。培养3～5h，移去含未粘附塑料表面的细胞悬液（即NA-NK细胞），收集粘附于塑料表面的细胞（即A-NK细胞），分别重悬于各自含50%自体条件培养基的培养液中，调成细胞浓度为2×10 6 /ml，同时补充IL-2，细胞至终浓度为6000IU/ml，继续培养，每3天补充新鲜培养液和IL-2，细胞浓度和IL-2终浓度不变 ［1］ 。
1.4 细胞增殖活性的测定 采用改进的四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法 ［2］ 。于培养的第1，4，7，10和第14天分别取细胞，充分洗涤，以1×10 6 /ml浓度加入96孔平底板中，每孔0.2ml，设3个复孔，培养箱中培养48h后，每孔加MTT（5mg/ml）20μl，继续培养4h，然后翻板，每孔滴加100μl二甲基亚砜（DMSO）轻轻振荡10min后在酶标仪上570nm处测定吸光度（OD值），取3孔均值，OD值高则增殖快。
1.5 细胞杀伤活性的测定 采用MTT法进行免疫活性细胞的细胞毒性测定。靶细胞为Anip973和K562肿瘤细胞，效应细胞为完全培养基和AIMV分别培养的A-NK细胞和NA-NK细胞，效靶比例为100:1。设立效应细胞和靶细胞共同孵育孔（E+T），效应细胞对照孔（E）和靶细胞对照孔（T），每组设3个复孔，操作方法同1.4。测定的OD值，取3孔均值，公式如下 ［2］ :细胞杀伤活性（%）=［1+（OD E+T -OD E ）/OD T ］×100
1.6 细胞表型分析 细胞诱导3～5h后，分别收集完全培养基和AIMV培养的A-NK细胞和NA-NK细胞，按5×10 5 个细胞/管，用美国Becton-Dickinson公司的流式细胞 仪检测并分析CD11 c 的表达。
1.7 透射电镜标本制备 在培养瓶中将A-NK细胞和K562肿瘤细胞共同培养，过夜，第二天取出离心（4000rpm×5min），用3%戊二醛固定30min（37℃）后按常规处理电镜标本。
1.8 统计学方法 采用样本均数的t检验。
2 结果
2.1 AIMV与完全培养基培养细胞增殖能力的比较 实验表明，除了第10天AIMV培养的A-NK细胞测得的OD值明显低于完全培养基培养的A-NK细胞外（P<0.01），其他时间AIMV与完全培养基培养细胞的增殖能力相当，并无统计学意义;AIMV和完全培养基培养的A-NK细胞均大量增殖，OD值明显高于同一培养条件下的NA-NK细胞;不同条件培养的细胞均在第7天达到增殖高峰，结果见表1。
2.2 AIMV与完全培养基培养细胞体外杀伤肿瘤细胞能力的比较 AIMV与完全培养基培养细胞体外杀伤肿瘤细胞的能力相当，并无统计学意义;在同一培养条件下培养的A-NK细胞，其杀伤活性明显高于NA-NK细胞;IL-2诱导的第7天是细胞杀伤活性的高峰期，结果见图1。
表1 AIMV与完全培养基培养细胞OD值的比较
图1 AIMV与完全培养基培养细胞杀伤活性的比较
2.3 AIMV与完全培养基培养细胞表达CD11 c 能力的比较AIMV与完全培养基培养细胞24h后表达CD11 c 的细胞百分数相当;在同一培养条件下培养A-NK细胞表达CD11 c 的能力要高于NA-NK细胞。
2.4 透射电镜结果 透射电镜下可见A-NK细胞在靶细 胞周围形成花环，部分细胞变形，形成的突起或微绒毛伸向靶细胞，呈点状或斑状接触。溶解坏死的肿瘤细胞，细胞内浆网肿胀，线粒体内外膜分离，胞质中出现空泡变性，核染色质破碎，核膜质膜破裂，最终细胞崩解;凋亡的肿瘤细胞，可见核染色质固缩、偏移，形成典型的致密月牙槽形聚集在核膜内侧面，基质水肿变性，但核膜质膜完整。
3 讨论
本实验在制备A-NK细胞的方法上力求简便快速，利用NK细胞在22nM（6000IU/ml）IL-2诱导下，能在3～5h迅速粘附到塑料表面上的这一特性，将收集细胞的时间缩小到3～5h［1］ 。由于以往采用尼龙毛柱过滤，操作复杂而难以推广应用，我们采用PME（5mmol/L）室温处理40min，以去除人外周血中某些抑制因素，如B细胞和单核巨噬细胞 ［3］ 。无血清培养基已经得到越来越广泛
(责任编辑：大汉昆仑王)
