质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳
互联网
|
（一）碱变性法提取质粒dna 质粒(plasmid)是细菌染色体外能自身独立复制的双股环状dna。带有遗传信息，可赋予细菌某些新的表型。将质粒指纹图谱分析方法、质粒dna探针技术及检测质粒的pcr技术用于临床感染性疾病的诊断和流行病学调查已成为现实。质粒作为载体在基因工程中起着重要的作用。 分离和纯化质粒dna的方法很多,但这些方法基本包括三个步骤：即细菌的培养和质粒dna的扩增，细菌菌体的裂解;质粒dna的提取与纯化。 本实验学习用碱变性方法提取质粒dna。 【原理】 细菌培养物加入sds和naoh碱性溶液处理后，菌体裂解，可使细菌的质粒dna、染色体dna和rna一起从细胞内释放出来，经琼脂糖凝胶电泳，因各种核酸分子的迁移率不同将上述核酸分成不同的带。用溴化乙锭（eb）染色后，在紫外线灯下可看到各种核酸带发出的荧光。根据荧光的位置，可区分不同的核酸带。 【材料】 1．菌株e.colijm109（puc19），e.colirri（pbr322） 2．试剂溶液(50mm葡萄糖,25mmtris.hclph8.0,10mmedta) 溶液ii(0.2nnaoh，1%sds)用前新配制 溶液iii(5mmkac溶液ph4.8) te缓冲液(10mmtris.hcl,1mmedtaph8.0) lb液体培养基(胰蛋白胨10g,，酵母粉5g,nacl10g.加蒸馏水溶解，用naoh调ph至7.5，加水至1000ml,15磅高压灭菌15分钟)。 【方法】 1．接种细菌于5mllb液体培养基中，370c培养过夜。 2．3000rpm/min,离心15min，弃上清。加入100ul溶液1悬起细菌沉淀。 3．加入200ul前新配制的溶液ii，颠倒ep管5次混合均匀，置冰浴2min。 4．加入150ul溶液iii温和地混匀，12000rpm/min,离心5min。 5．吸取上清清亮裂解液放入另一新ep管中，加等体积酚-氯仿-异戊醇抽提2次，12000rpm/min,离心2min。（若不做酶切，此步可省略）吸取上清放入另一新ep管中，加入二倍体积的冷乙醇，12000rpm/min,离心10min。 6．弃乙醇，干燥后用30ulte缓冲液洗下核酸，待电泳检测。 （二）琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳技术（agarosegelelectroghoresis）是分离、鉴定和提纯dna片断的有效方法。凝胶分辨率决定于使用材料的浓度，并由此决定凝胶的孔径。琼脂糖凝胶可分辩0.1~6.0kb的双链dna片段。琼脂糖凝胶电泳是一个电场作用。它首先利用琼脂糖的分子筛效应，此外，在弱碱性条件下，dna分子带负电荷，从负极向正极移动。根据dna分子大小、结构及所带电荷的不同，它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。借助溴化乙锭（eb）能与双链dna结合的作用，利用eb染色，并通过紫外线激发即可观察被分离dna片段的位置。 【材料】 1．琼脂糖、10×tae电泳缓冲液（40mmtris,20mmnaac,1mmedtaph8.0） 2．载体缓冲液（0.25%溴酚蓝，30%甘油）、溴化乙锭水溶液（10mg/ml） 3．凝胶槽、电泳仪 【方法】 1．取琼脂糖0.9g，加入100ml1xtae电泳缓冲液于250ml烧瓶中，1000c加热溶解。 2．平衡凝胶槽，放好两侧挡板，调节好梳子与底板的距离（一般高出底板0.5~1mm）。 3．铺板：在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5ug/ml的溴化乙锭水溶液，轻轻混匀，待冷至500c左右倒入凝胶槽，胶厚一般为5~8mm。 4．待胶彻底凝固后，去掉两侧挡板，将凝胶放入盛有电泳液的槽中（加样孔朝向负极端，dna由负极向正极移动），使液面高出凝胶2~3mm，小心拔出梳子。 5．dna样品与载体缓冲液5：1混合并加入凹孔中（样品不可溢出）。 6．打开电源，调节所需电压，电压与凝胶的长度有关，一般使用电压不超过5v/cm。 7．据指示染料移动的位置，确定电泳是否终止（溴酚蓝的涌动距离在5srna和0.3kbdna带之间）。
8．电泳完毕关闭电源。将凝胶放紫外灯下观察并拍照。 |
