丁香实验_LOGO
登录
提问
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

DNA序列分析

互联网

2368
佚名
 

 

DNA的一级结构决定了基因的功能,欲想解释基因的生物学含义,首先必须知道其DNA顺序。因此DNA序列分析(DNa sequencing)是分子遗传学中一项既重要又基本的课题。

  1986年由美国学者提出的,目前正在实施的人类 基因组 计划(human genome project),则是要通过对人类基因组3×109bp全序列的序列分析和人类基因的染色体图谱制定达到了解其结构,认识其功能,即从分子遗传学水平来认识人类自身的结构和功能特征的目的。

核酸的核苷酸序列测定方法已经过近20年的发展,因而测序的具体方法五花八门、种类繁多。但是究其所依据的基本原理,不外乎Sanger的核酸链合成终止法及Maxam和Gilbert的化学降解法两大类。虽然原理不同,但这两种方法都同样生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸,每组寡核苷酸都有固定的起点,但却随机终止于特定的一种或多种残基上。由于DNA链上每一个碱基出现在可变终止端的机会均等,因而上述每一组产物都是一些寡核苷酸的混合物,这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA片段上的位置所决定。然后在可以区分长度仅相差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下,对各组寡核苷酸进行电泳分析,只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道之上,即可从凝胶的放射自显影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。以下分别介绍。

1.Sanger双脱氧链终止法

DNA的合成总是从5′端向3′端进行的。DNA的合成需要模板以及相应的引导核酸链。DNA的合成过程中,在合成的DNA链的3′末端,依据碱基配对的原则,通过生成新的3′,5′-磷酸二酯键,使DNA链合成终止,产生短的DNA链。具体测序工作中,平行进行四组反应,每组反应均使用相同的模板,相同的引物以及四种脱氧核苷酸;并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸,使其随机地接入DNA链中,使链合成终止,产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开,经过放射自显影显示区带,就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列(图15-3)。

图15-3 双脱氧链终止法测定DNA序列原理示意

2.Maxam�Gilbert DNA化学降解法

这一方法的基本步骤为(1)先将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P;(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰;(3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链;(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开;(5)根据放射自显影显示区带,直接读出DNA的核苷酸序列(图15-4)。

图15-4 化学裂解法测定DNA的核苷酸序列

 

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序