品系对小鼠胚胎干细胞分离效率的影响

李相运 邸科前，魏 巍
(1．河北农业大学动物科技学院，河北保定071001；2．北京大学生命科学学院，北京100871)
摘要：为了充分利用小鼠胚胎干(ES)细胞，就必须从众多小鼠品系中分离ES细胞系。本研究通过传统的成纤维细胞饲养层法，从CD一1、129／Sv、C57BL／6J和129／Sv X C57BL／6J四种不同遗传背景的小鼠中分离得到12个ES细胞系，而从KM小鼠没有得到ES细胞系。所有的ES细胞系都具有典型的ES细胞特征，AKP染色呈阳性。从四种不同遗传背景的Es细胞系得到了包含多种组织的畸胎瘤；与桑椹胚聚合后，都得到了生殖系嵌合体。结果表明：品系对小鼠Es细胞的分离有显著影响，利用129小鼠以及包含129小鼠遗传背景的杂交小鼠都较容易分离Es细胞，由Es细胞得到生殖系嵌合体的效率在不同品系问有显著差异，从杂交Es细胞比近交Es细胞中更容易得到生殖系嵌合体。
关键词：小鼠；品系；胚胎干细胞；嵌合体

Efects of Genetic Background on Establishment of
M ouse Embryonic Stem Cells
LI Xiang—yun ， ，DI Ke—qian ，W EI W ei
r1．College ofAnimal Science and Technology，A ultural University ofHebei，Baoding 071001，China；
2．College of蛳Science，Peking University，Beijing 100871，China)
Abstract：For utilization of the mouse embryonic stem (ES)cells for various purposes．it is desirable that the cell
lines are established from various SOUrCes such as inbred and outbred mouse strains．So far。however，most ES cell lines used in genetic manipulation have been derived from the 1 29／Sv strain．In this paper．we have established ES cell lines from blastoeysts of the CD一1．C57BL／6J and 1 29／Sv X C57BL／6J mice besides 1 29／Sv mouse with a fibroblast cell as feeder cells．and supplemented with 1，000 unit／mL LIF in the culture medium．Twelve ES cell lines were obtained from CD一1．129／Sv。C57BL／6J and 129／Sv X C57BL／6J mouse blastocysts．No ES cell line from KM embryos suggests that KM strain might have inhibitory genetic factor(S)for the ES cell formation．Some ES cell lines could be obtained from hy—brids at high efficiency suggested a heterosis effect can be expected for establishing ES cell lines in mice．These ES cell lines produced chimeric mice and contributed to the germ—line．The results indicate that genetic background iS an impor．tant factor in isolating ES cells．
Key words：Mouse；Strain；Embryonic stem cell；Chimera

胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES)是从囊胚内细胞团(inner cell mass，ICM)分离而来的一种多能性细胞(Evans&Kaufman，1981；Martin， 1981)，在体外培养过程中可维持干细胞的未分化状态、正常二倍体核型和无限增殖能力，具有体内外分化能力和种系嵌合能力(Nagy et al，1990； Eggan et al，2001)，并可对ES细胞在体外进行遗传操作、选择和冻存而不失其多能性。小鼠Es细胞不仅可以作为体外研究细胞分化和发育调控机制的模型，而且还可以作为一种载体，将通过同源重组产生的小鼠基因组的定点突变导入小鼠胚胎，得到转基因小鼠，实现在个体水平上的基因剔除，为更深入地研究基因结构与功能、胚胎发育、癌症以及各种遗传病的机理开辟了新途径。小鼠Es细胞的建系工作是实现小鼠ES细胞途径的基础。

不同小鼠品系来源的ES细胞有不同的特性，如国际上通用的ES细胞系大多是从129品系小鼠中获得的，但129品系小鼠不宜用于免疫学和细胞组织移植研究；来自BALB／c小鼠的ES细胞克服了129小鼠ES细胞的这些缺点，体外培养生长速度快、稳定性好，该细胞系的细胞及其分化产物在接种到同种小鼠体内，不发生异体排斥反应，在医学免疫学研究中显示了其独特的优点；C57BL／6小鼠在动物行为研究中得到广泛应用，并且易于饲养和管理，克服了129小鼠自身存在的诸多缺点，具有致癌性不敏感和对鼠痘病毒有良好的抗性等优点；远交群KM品系和ICR品系，具有较强的生命力和抗病能力。由此可见，为了各种不同的研究和应用目的，最好能有不同品系来源的ES细胞系。许多实验室的工作都已证明用于种系嵌合的ES细胞应尽可能是处于传代早期的细胞，且不同小鼠品系来源的ES细胞的种系嵌合能力有显著差异，因此，从事ES细胞研究的实验室应当不断建立各种遗传背景的新的Es细胞系。本实验以5种不同遗传背景的小鼠为材料，探讨了品系对分离小鼠Es 细胞的影响。

1 材料和方法
1．1 溶液配制
无钙镁PBS缓冲液、胰蛋白酶消化液、DMEM培养液、ES 细胞培养 液、丝裂霉素C溶液以及M2
胚胎操作液的配制见Erbach et al(1994)和Nagyet al(2003)。
1．2 小鼠胎儿成纤维细胞的分离培养
取妊娠14 d的CD一1小鼠，脱颈处死，取出胎鼠，用PBS洗掉身上残留的粘液。去掉胎儿的头、内脏、四肢、尾，用PBS洗2次。用眼科剪剪至1mm 组织块大小，向组织块中加入适量消化液，消化15 min。加DMEM培养液终止消化，并用100ktm滤纱过滤于10 mL离心管中，1 000 r／min离心5 min，弃去上清液，加入5 mL DMEM培养液并吹打，使细胞悬浮。二次离心、弃上清液，加入3mL培养液，吹打制成细胞悬液。移人直径9 cm培养皿并补加8 mL培养液，置人含5％ CO2的37℃培养箱中培养(饱和湿度)，30 min后更换培养液，以后每隔2 d换一次培养液。
1．3 成纤维细胞饲养层制备
将铺满成纤维细胞(5代以内)的培养皿中的培养液移去，加人丝裂霉素C溶液5 mL，置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养4 h。移去丝裂霉素C溶液，用PBS液洗涤3次，加入5 mL消化液消化2 min，使细胞离散，再加入等体积培养液终止 肖化，制成细胞悬液。然后于四孔板每孔中加人0．15 mL成纤维细胞悬液，再补加0．7 mL培养液，用移液枪充分吹打，以确保成纤维细胞能够均匀沉降于孔底。置培养箱中培养24 h后待用，用
前换液。
1．4 小鼠胚胎的采集
实验用5种小鼠由北京大学医学部实验动物部提供。鼠房温度22～25 ，湿度40％ ～70％ ；光照周期采用12L：12D，每日7：o0—19：0o光照。选取处在间情期的4周龄母鼠于14：0o腹腔注射PMSG (天津市激素制品厂)10 U／只，48 h后腹腔注射HCG 10 U／只。注射后与公鼠1：1合笼，次日早晨检查阴道栓。见栓母鼠于3 d后取囊胚。在实体显微镜下先将变性或不正常的胚胎剔除掉，然后再将正常的囊胚和桑椹胚转移到饲养层上，置培养箱培养。

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