植物花粉生活力测定技术

在育种工作中，有时需要将花粉保存一段时间。虽然人们已经知道，花粉保存以温度较低（0～15℃），空气湿度稍干（不能太干）、黑暗条件下为宜。但是各种不同植物花粉寿命长短相差悬殊，这一是由花粉本身的特征决定的，二是由贮藏条件决定的。一般来说，禾谷类作物花粉的寿命较短，自花授粉植物花粉的寿命尤其短，如小麦在花药开裂后30min，花粉即由鲜黄色变为深黄色，此时已有大量花粉丧失活力。在许多特殊条件下，花粉的生活力的测定显的很重要，如：
1．外地采集来的花粉或杂交时父本花期早于母本时都要将花粉进行短暂贮藏；
2．自交或远缘杂交时，为了分析结实率或不结实原因时；
3．为了鉴定雄性不育系时；
4．了解某些杂交技术时，如测定花粉的刺激等作用，测定受精选择性等。
因此，要根据各种植物花粉的特点，采取适当的保存方法。花粉生活力的测定方法很多，其中发芽试验手续较复杂，设备要求较高，需时也较长。为了简易而迅速的测定花粉生活力，也常采用化学染色的方法，但是此法也有缺点，就是染上色的花粉不一定都具有生活力，因为染上色的花粉中也包括了那些生活力弱不能正常发芽的花粉，所以一般常用而且较为可靠的方法仍然是采用花粉发芽实验。要是要求不严格对新采集的花粉还有一个较简便的鉴定方法——形态鉴定法。
本实验目的是学习花粉生活力测定的方法，进而研究花粉寿命长短与环境条件的关系，以探求保存花粉的合适方法。
一、试材及用具
1．材料：几种植物的不同处理花粉；如：小麦、玉米、大白菜、黄瓜、杏、苹果等。
2． 试剂 ：配制好的缓冲液、联苯胺液、过氧化氢液、TTC粉、蔗糖、琼脂等；
3．用具：显微镜、载玻片、盖玻片、凹面载玻片、玻璃棒、擦镜纸、吸水纸、标签纸、铅笔。
二、方法步骤
（一）直接检验法
每个实验小组选定同品种种株去雄。注意：选用的花蕾最好是花前1～2d，且发育正常、饱满。每天去雄20个花蕾，然后套袋隔离，连续5d，共100朵花。这一实验要和花粉贮藏实验相配合，即花粉贮藏的当天开始去雄。授粉时，每去雄一次，分别授以两种不同贮藏条件下的花粉（各10朵），连续5d，就使得贮藏期分别为当天、第二天、第三天、第四天、第五天的花粉授到了去雄后的花蕾上。实验时，一定要挂牌标好品种、花粉贮藏期、贮藏条件、株号、授粉日期、授粉人。等最后一个处理完后十天，检验结实率和结籽率。将得到的结果填入表1－6。
（二）染色鉴定法（TTC法）
TTC即2、3、5－三苯基四唑氯化物。主要原理在于检验花粉呼吸过程中去氧酶的活性。具有生活力的花粉的脱氢酶，在催化去氢的过程中，把氢转移到其他的物质上去，使用TTC与催化过程中产生的氢结合成红色化合物，从而使具有生活力的花粉变为红色。
1．先配制下列溶液
（1）磷酸缓冲液：在100毫升的 蒸馏 水中，溶解0.832克的磷酸氢二钠和0.273克的磷酸二氢钾，调整PH值为7.17。
（2）TTC溶液：称取0.02～0.05克（不同植物所用的量是不同的）的TTC溶解在10ml的磷酸缓冲液中，溶液配好后装入棕色滴瓶内，置入暗处，因氯化三苯基四唑有毒，操作时要注意安全。
2．操作步骤：
（1）取少量花粉放在载玻片上，并在花粉上滴上1～2滴配制液，用玻璃棒混合后盖上盖玻片。
（2）将载玻片置于恒温箱中（35～40℃）约15～20min。
（3）在显微镜（10×10）下观察：凡具有生活力的花粉呈红色，部分丧失生活力的呈淡红色，无色的是死的和不育的花粉粒。
3．观察和测定结果：每片观察3个视野，并统计具有生活力花粉的百分率，填入表1－6。
（三）发芽测定法（培养基培养法）
1．培养基的配制
常用的花粉发芽培养基有液体和固体两种。以前者最为简便。本实验选用前者。其有效成分主要有：蔗糖、硼酸、柠檬酸、赤霉素等。不同的植物所用的蔗糖培养液的浓度是不同的，配制3～30%的蔗糖培养液：在100ml水中，加糖3～30g，加热溶解后，再加0.1%硼酸数滴。
2．制片
取双凹载玻片，滴2滴培养液于槽中，用解剖针挑少许花粉均匀撒于培养液的表面（注意不必搅拌，以防花粉混于液体中因缺少空气而影响发芽，又因花粉深浅不一而在显微镜检查时因光线折射而不易观察。）处理好后，放于一下部添有少量 蒸馏 水、内有两根玻璃棒的培养皿中（注意不要使水没过载玻片），放到恒温为25℃左右的 恒温箱 中或室内2h。
3．镜检
将放置2h后的载玻片取出，放在显微镜下观察三个视野，统计总花粉数与发芽的花粉数，然后计算比例，填入下面的表格中。
（四）形态鉴定法
对于新采集的花粉来说，还有一个更为简便的鉴定方法——形态鉴定法。将花粉用解剖针播于一般载玻片上，然后直接放到显微镜下观察，根据形态特征，判断花粉的生活力状况，一般来说，畸形、皱缩、小形化等均为无生活力花粉，而有光泽、饱满、具有本品种花粉典型特征等性状的均为有生活力花粉。