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微生物的诱变育种

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一、实验目的和内容
目的:以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例,学习微 生物 诱变育种的基本操作方法。
内容:1.对米曲霉(Aspergills oryzae )出发菌株进行处理,制备孢子悬液。
2.用紫外线进行诱变处理。
3.用平板透明圈法进行两次初筛。
4.用摇瓶法进行复筛及酶活性测定。
二、实验材料和用具
米曲霉斜面菌种;
豆饼斜面培养基、酪素培养基、蒸馏水、0.5%酪蛋白;
三角瓶(300mL、500mL)、 试管 、培养皿(9cm)、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力 搅拌器 、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。
三、操作步骤
(一)出发菌株的选择及菌悬液制备
1.出发菌株的选择 可直接选用生产酱油的米曲霉菌株,或选用高产蛋白酶的米曲霉菌株。
2. 菌悬液制备 取出发菌株转接至豆饼斜面培养基中,30℃培养3~5d 活化。然后孢子洗至装有1mL 0.lmol/L pH6.0 的无菌磷酸缓冲液的三角瓶中(内装玻璃珠,装量以大致铺满瓶底为宜),30℃振荡30min,用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤,制成把子悬液,调其浓度为10 6 ~10 8 个/mL,冷冻保藏备用。
(二)诱变处理
用物理方法或化学方法,所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定,有时还可采用复合处理,可获得更好的结果。本实验学习用紫外线照射的诱变方法。
1.紫外线处理 打开紫外灯(30W)预热20min。取5mL 菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中,同时制作5 份。逐一操作,将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处的磁力 搅拌器 上,照射l min 后打开培养皿盖,开始照射,与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌,即时计算时间,照射时间分别为15 s、30 s、l min、2 min、5 min。照射后,诱变菌液在黑暗冷冻中保存1~2h 然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。
2.稀释菌悬液 按10 倍稀释至10 -6 ,从10 -5 和10 -6 中各取出0.lmL 加入到酪素培养基平板中(每个稀释度均做3 个重复),然后涂菌并静置,待菌液渗入培养基后倒置,于30℃恒温培养2~3d。
(三)优良菌株的筛选
1. 初筛 首先观察在菌落周围出现的透明圈大小,并测量其菌落直径与透明圈直径之比,选择其比值大且菌落直径也大的菌落40~50 个,作为复筛菌株。
2.平板复筛 分别倒酪素培养基平板,在每个平皿的背面用红笔划线分区,从圆心划线至周边分成8 等份,1~7 份中点种初筛菌株,第8 份点种原始菌株,作为对照。培养48h 后即可见生长,若出现明显的透明圈,即可按初筛方法检测,获得数株二次优良菌株,进大摇瓶复筛阶段。
3.摇瓶复筛 将初筛出的菌株,接入米曲霉复筛培养基中进行培养,其方法是,称取麦秩85g,豆饼粉(或面粉)15g,加水95~110mL(称为润水),水含量以手捏后指缝有水而不
下滴为宜,于500mL 三角瓶中装入15~20g(料厚为1~1.5cm),121℃湿热灭菌30min,然后分别接入以上初筛获得的优良菌株,30℃培养,24h 后摇瓶一次并均匀铺开,再培养24~48h,共培养3~5d 后检测蛋白酶活性。
4.蛋白酶的测定方法
(1)取样:培养后随机称取以上摇瓶培养物1g,加蒸馏水100mL,(或200mL),40℃ 水浴 ,浸酶1h,取上清浸液测定酶活性。另取lg 培养物于105℃烘干测定含水量。
(2)酶活性测定:30℃ pH7.5 条件下水解酪蛋白(底物为0.5%酪蛋白),每分钟产酪氨酸1μg 为一个酶活力单位。计算公式为:
(A 样品OD680nm 值-A 对照OD680nm 值)×K×V/t×N
K:标准曲线中光吸收为“1”时的酪氨酸微克数;
V:酶促反应的总体积;
t: 酶促反应时间(min);
N:酶的稀释倍数。
5.谷氨酸的检测 此项检测也是酱油优良菌株的重要指标之一。
检测培养基:豆饼粉:麸夫=6:4,润水75%,121℃湿热灭菌30min。
谷氨酸测定:于以上培养基中加入7%盐水(W/V),40~45℃ 水浴 ,水解9d 后过滤,以滤液检测谷氨酸含量(测压法)。
四、注意事项
1. 紫外线照射时注意保护眼睛和皮肤。
2. 诱变过程及诱变后的稀释操作均在红灯下进行,并在黑暗中培养。
五、实验报告
1. 试列表说明高产 蛋白酶 菌株的筛选过程和结果。
2. 你认为以上的筛选方法有什么优缺点,如何改进?
六、问题和思考
1.试述紫外线诱变的作用机理及其在具体操作中应注意的问题。
2.为什么在诱变前要把菌悬液打散和培养一段时间?
注:筛选菌株数的计算 若按突变率为0.01 计算,则一次筛选可取250—300 个菌落,
第一次筛选后可多选几株高产株,而二级筛选为重点阶段,其最适量可参考以下计算方法:如初筛菌株数为200 株,二次筛选欲选株数为2 株,则二级应选(200×2) 1/2 ,为20 株,这样的数量选择,使有可能从较少的数量中获得相对较多的优良菌株。
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