细胞冻存、解冻方法以及细胞计数

一、细胞冷冻保存
1、材料：
生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO（Sigma D-2650）、无菌塑料冷冻保存管（Nalgene　5000-0020）、0.4％（w/v）trypan blue（GibcoBRL15250-061）、血球计数盘与盖玻片、等速降温机（KRYO10SeriesII）。
2、冷冻保存方法：
（1）传统方法：冷存管置于4℃10分钟→ -20℃30分钟→ -80℃16～18小时（或隔夜）→液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
3、步骤：
（1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。
（2）配制冷冻保存溶液（使用前配制）：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5～10％，混合均匀，置于室温下待用。
（3）依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液（约0.1ml）计数细胞浓度及冻前存活率。
（4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。
4、注意事项：
（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（logphase）且存活率高之状态，约为80–90％致密度。
（2）冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
（3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为 试剂 级等级，无菌且无色（以0.22micron　FGLP　Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650），以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为 试剂 级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。
（4）冷冻保存之细胞浓度：
①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml
②hybridoma：1～3×106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。
③adherent tumor lines：5～7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ml
④other suspensions：5～10×106cells/ml，human lymphocyte须至少5×106cells/ml。
（5）冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。

二、冷冻细胞活化

1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。
2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常（例如产生单株抗体或是其它蛋白质）。
3、材料 ：37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/ 离心管 /培养瓶、液氮或干冰容器 。
4、步骤：
（1）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。
（2）自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。
（3）将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。
（4）取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。
（5）取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内（稀释比例为1：10～1：15），混合均匀，放入CO ₂ 培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。
（6）解冻后是否立即去除冷冻保护剂（例如DMSO或glycerol），依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之 离心管 内，离心1000rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO ₂ 培养箱培养。
（7）若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。