细胞介导细胞毒作用检测法-单细胞CMC试验

1．用 细胞培养 液等量混合效应细胞和靶细胞，30℃水浴10分钟。室温中250×g离心5分钟，去上清液。同量靶细胞不加效应细胞同样处理作为对照。

2．用少量 细胞培养 液轻轻悬浮细胞，吸管上下吹打5～6次。这一分散细胞的步骤关系到试验的准确性和重复性，应当设法保持技术的一致性。取少许细胞悬液，稀释后直接在显微镜下计数效应细胞和靶细胞的结合率，即平均每100各淋巴细胞中结合了靶细胞的效应细胞的数目。

3．其余的细胞悬液与等量液态（37℃）的0.5％低熔点琼脂糖混合均匀，铺在培养皿中，厚度≤2mm。固化后小心加入适量 细胞培养 液覆盖 琼脂 糖层，置37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养1～4小时。

4．吸去培养液，加入适量0.1％台盼蓝覆盖 琼脂 糖层，室温染色5分钟。吸去染色液，加入适量0.2％甲醛覆盖琼脂糖层，室温固定5分钟。

5．在显微镜下死亡细胞呈蓝色，计数靶细胞的死亡率。靶细胞的自发死亡率可以从经同样处理的靶细胞对照培养皿中测得。如区分效应细胞和靶细胞有困难，可以用双醋酸荧光素染色加以区分。镜下计数。