通过优化由软件控制的加、减速率离心分离单核细胞

概述
如今越来越多的临床与细胞实验室检验项目对快速处理样品提出了更高的要求。对于样品分离的常规离心技术，更是需要具有尽可能快的加速和与之相应的减速，以缩短许多诸如培养细胞等温度敏感的样品在离心机中存留过长的时间。Eppendorf根据这方面应用的要求，开发并推出5702、5702R、5702RH系列离心机，已经成功地将离心机加速和减速时间缩短至25秒以内。

除了速度，另一个影响或评价临床与细胞实验室离心质量的指标是重混率。在这一方面的技术改进体现为以秒为级别的快速加减速同时兼顾柔和地保护样品，这项功能被称为“Soft”功能，特别适用于灵敏度要求很高的样品，如通过密度梯度离心法反复高效地分离细胞。从全血中分离单核细胞以及之后对它们分别进行分类是细胞学实验室常规的一项操作，这类细胞主要包括T细胞、B淋巴细胞和单核细胞。离心分离单核细胞，目前主要是通过利用由多聚糖Ficoll形成的密度梯度来实现的。红细胞的密度较高，因而离心后位于Ficoll层（密度1.077g/ml）之下形成血细胞沉淀，而且多聚糖与血细胞交联更加速了沉淀的过程。由于淋巴细胞、血小板与单核细胞形成的血浆层密度低于1.077g/ml，因而离心后位于Ficoll层以上而得到富集。

本文主要讲述：通过不断优化5702离心机的控制软件，以期对比改进前后Soft功能所取得的不同分离效果。

1.将10ml Biocoll细胞分离液（包括Ficoll®400、Biochrom AG）在室温条件下 加入50ml锥底离心管（Falcon®、BD Bioscience）。
2.用HBSS（Hanks平衡盐溶液，Invitrogen）将人血2倍稀释。
3.将35ml人血稀释液加入离心管使其覆盖于Ficoll层之上，注意不要将血和 Biocoll混合。
4.离心30分钟、1600 rpm（440×g），并设置是否使用Soft功能的两组对照。 使用的离心机为Eppendorf 5702，转子A-4-38，锥底离心管适配器 5702 734.004。
5.用数码相机分析梯度分离效果。
6.将位于单核细胞层上的约1cm左右的HBSS、血小板和血浆悬浮部分移去。
7.用10ml移液器将单核细胞层小心地移至一个干净的50ml离心管，每管最多 加入20ml，所有这些都在冰上操作。
8.用HBSS将每管单核细胞浓缩液稀释配平至50ml，充分混匀后离心10分钟、 1600 rpm（440×g），注意关闭刹车键。
9.离心后弃去上清，将沉淀重悬于1ml HBSS，重复步骤7。
10.最后，离心后弃去上清，将细胞沉淀重悬于5ml 培养基，细胞计数并检测细 胞大小。该步使用50μl 细胞培养 液混合10ml计数液（IsotonⅡ，Bechmann Coulter，Krefeld），并使用Coulter 256通道仪分析。

材料和步骤

通过多种离心功能的应用，我们得到不同试验结果，最初通过目测分析梯度分离的效果，而后可以对富集得到的单核细胞的培养计数与分析，判断并验证目测的分层效果。再次强调，该组实验所使用的样品血采自同一供体并分为四组对比实验，两管使用5702型离心机，而另两管作为对照组使用5810型离心机的水平转子A-4-44及相应的5ml锥形底离心管适配器5804 758.005。

众所周知，5810型离心机具有九个加/减速档，并设置O档即最低加/减速。该档也被用于本次实验以考查其对分离效果的影响。

首先，我们需要明确的是，在我们的分离实验中所有使用的5702进行离心的步骤中都同时启动了刹车功能。