啤酒酵母菌营养缺陷型菌株的筛选

一、实验原理

利用化学诱变剂诱发突变是遗传学研究和育种工作的常用手段。

化学诱变剂按其诱变机理一般可分为三类：（1）通过掺入DNA分子引起突变，（2）通过和DNA直接起化学反应后引起突变，（3）通过一对核苷酸的插入或缺失引起突变。本实验以烷化剂亚硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）为诱变源，它的诱变机理属于第二类。现在一般认为烷化剂的诱变机理主要是由于对鸟嘌呤N-7位置上的烷化作用（鸟嘌呤其它位置以及其它碱基的许多位置也可能被烷化），然后被烷化的碱基同碱基结构类似物作用机制一样，通过DNA复制，引起碱基错误配对导致碱基转换或颠换造成基因突变。通常烷化后的碱基（G）偶然与胸腺嘧啶（T）错误配对代替胞嘧啶（C）。

NTG主要诱发GC—AT的转换。它除有较强的诱变作用外，还能诱发邻近位置基因的并发突变，而且特别容易诱发DNA复制叉附近的基因突变，随着复制叉的移动，它的作用位置也随着移动。

NTG是一种超诱变剂，它的诱发效率可使百分之几十的细菌发生营养缺陷型突变，因此经NTG处理的细菌不必经过青霉素浓缩处理，而只要通过适当的筛选方法就能检出营养缺陷型。一般讲，一种高效率的诱变剂，只要有一种有效的筛选方法是可以获得任何突变型的。

诱变处理所用的细胞一般为对数期细胞。化学诱变剂的剂量一般以药物浓度表示。一定的剂量有一定的杀菌率和诱变率，通过杀菌率和诱变率可帮助我们了解一定剂量的诱变作用。诱变作用往往与药物处理时间和温度有关。具有较强诱变作用，较弱杀菌作用的诱变剂（如烷化剂）可采用较低剂量（约50％的杀菌率），反之，紫外线一般采用较高杀菌作用的剂量（如90％—99.9％杀菌率）。

二、实验材料

1.啤酒酵母菌单倍体26－4（来自上海酵母厂）。

2.啤酒酵母菌单倍体143—2（来自上海酵母厂）。

三、实验器具和药品

1.用具：培养皿（9厘米），三角瓶（150毫升），试管，离心管，吸管（1毫升、5毫升），玻璃涂棒，玻璃珠，丝绒布，圆木柱。

2.培养基

（1）基本培养基：葡萄糖10克，CaCl ₂ ·2H ₂ O0.1克，KH ₂ PO ₄ 0.876克，（NH ₄ ） ₂ SO ₄ 1克，K ₂ HPO ₄ 0.125克，MgSO ₄ ·7H ₂ O0.5克，NaClO.1克，KI母液1毫升，微量元素母液1毫升，维生素母液1毫升，蒸馏水加到1000毫升。高压灭菌8磅25分钟。

注：①碘化钾母液：1克/毫升。

②微量元素母液：H ₃ BO ₃ （硼酸）1毫克/100毫升、ZnSO4·7H2O（硫酸锌）7毫克/100毫升、CuSO ₄ ·5H ₂ O（疏酸铜）1毫克/100毫升、CoCl ₂ ·6H ₂ O（氯化钴）5毫克/100毫升。

③维生素母液：维生素B ₁ 40毫克/100毫升、烟碱酸40毫克/100毫升、肌醇200毫克/100毫升、核黄素20毫克/100毫升、对-氨基甲酸20毫克/100毫升、吡哆醇40毫克/100毫升、泛酸20毫克/100毫升、 生物 素3毫克/100毫升。以上三种母液都需高压灭菌15磅15分钟。

（2）基本固体培养基：在上述培养基加2％琼脂即可。

（3）完全液体培养基：蛋白胨20克、酵母浸出汁10克、葡萄糖20克、蒸馏水1000毫升，pH6.0，高压灭菌8磅25分钟。

（4）完全固体培养基：在上述培养基加2％琼脂即可。

（5）无菌水

（6）生理盐水（0.85％）

（7）0.2mol/L磷酸缓冲液（pH6.0）：0.2mol/LNa ₂ HPO ₄ 12.3毫升、0.2mol/LNaH ₂ PO ₄ 87.7毫升。

3.诱变剂：亚硝基胍（NTG）。