人类人工染色体的构建策略

摘要： 目前各种应用于基因治疗领域的载体均存在一定的局限性。越来越多的研究者认为，最理想的基因治疗载体应该在染色体的结构基础上构建，使目的基因整合后能够作为独立的功能单位表达，或者成为游离基因而稳定存在。人类人工染色体（human artificial chromosome, HAC）的出现，使这种设想成为可能。近年来，研究者们基于两种基本策略相继构建多种HAC，并以之作为载体进行了一系列外源性基因表达研究，尽管还有许多问题亟待解决，但并不妨碍人们对之成为理想的基因治疗载体寄予厚望。
关键词： 人类人工染色体； 载体； 基因治疗
中图分类号： R394

理论上讲，理想的基因治疗载体应该完全由天然染色体成分组成，至少具备三个结构要素：复制原点、端粒和着丝粒。当其进入靶细胞后，目的基因能够模拟自然条件下基因表达或者作为游离基因而稳定复制，即可控性表达，这是基因治疗成功的关键所在。外源性基因进入靶细胞后，若其表达处于失控状态，将带来严重的后果。最理想的可控性模式是模拟人类基因自然状态下的调控形式，实现这种可控性表达需要目的基因全长或包括上下游的调控区及内含子，这就对载体系统提出了极高的要求，它必须具备数十个kb到几百个kb的包装能力，同时还要考虑到重复序列的DNA重排和丢失问题；其次，一个如此长的片段进入细胞内，其整合位点相当重要，最终理想是能够实现定点插入，或者作为一个游离基因表达。传统的基因治疗载体，如逆转录病毒载体、腺病毒载体等，很难达到以上要求，并且存在免疫异源性、插入诱变等许多问题。
1． HAC的构建策略
人工染色体的构想，为载体研究提供了新的思路。这类载体不需要病毒蛋白质衣壳；能够象天然染色体一样以线状或环状存在；同时，在缺乏选择压力的情况下，能够以较低的拷贝数在细胞内稳定存在；有无限的克隆能力；不但能插入靶基因，还能插入其他的调控元件或特异性细胞靶向元件。基于上述优点，研究者们对其倾注了不懈的努力。1983年，酵母人工染色体构建成功，14年后，第一个HAC的成功构建，被认为是基因治疗载体研究领域的重大突破。此后，研究者相继构建了各种不同的HAC。目前，构建HAC基于如下两种策略。
（1） 自上而下的策略 该策略是以天然染色体的断裂片段为基础，构建新的HAC。这些断裂片段主要通过以下方法得到：（a）低剂量辐射;（b）端粒定位染色体截断技术（见图1）;（c）外源性DNA片段定点插入后扩增;（d）天然染色体有丝分裂过程中自发产生的碎片。研究者发现，将外源性端粒DNA整合入哺乳动物染色体，可将该染色体截断，同时在断端产生新的端粒。研究者们应用这种技术修剪哺乳动物染色体，成功构建了一系列大小在0.5～6 Mb之间不等HAC。最初，端粒DNA整合的位点是随机的，而现在，研究者们能够将端粒DNA定点插入染色体中特定的位点。所获得的这些微型染色体在结构上相当稳定。Grimes等[1,2]将外源性DNA插入小鼠和人类染色体着丝粒区，扩增这些DNA导致染色体裂解为60～400 Mb大小的片段，然后纯化这些片段用于显微注射或者脂质体介导的转染以构建HAC。另外，研究者还利用自然条件下人类染色体有丝分裂产生的碎片（hCF），通过微细胞介导染色体转移技术，构建人类微型染色体载体。以上的微型人工染色体中，有相当一部分被证实对小鼠生殖细胞系细胞有高效的转染能力，同时，这些线状HAC的大小和结构已基本清楚，有望作为载体应用于基因治疗。
（2） 自下而上的策略 该策略是在细胞内或者细胞外将着丝粒DNA、端粒DNA以及复制原点装配在一起，从而构建HAC。研究者应用这种策略，在HT1080细胞中得到了第一种HAC。他们将>1 Mb的人17号染色体的α卫星DNA、人端粒DNA、人基因组DNA随机片段用脂质体共转染HT1080细胞。经过重组，那些同时含有着丝粒、端粒、复制起点且按照正常染色体结构顺序的重组连接产物以染色体的形式稳定保存下来，而那些不完整或未按照正常顺序连接的产物因其不能稳定地进行有丝分裂而丢失、降解。由此通过有丝分裂而自然筛选出HAC。其后，在相同细胞系内，研究者们将包含α卫星DNA和端粒序列的环状或者线状DNA分别引入酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体人工染色体（PAC）中，构建了多种的HAC。它们以较低的拷贝数存在于细胞中，并表现出很高的有丝分裂稳定性。有趣的是，尽管引入了端粒序列，这些重组人工染色体中的绝大多数都呈环状，而并非如预料的那样呈线状结构。最近的研究证实，应用缺乏端粒DNA序列但包含有70 kbα卫星DNA的PAC即可构建出有丝分裂稳定的环状HAC，这一发现有助于人们进一步了解构建HAC所需要的最小功能单位。对这些重组人工染色体进行免疫组化分析，发现了着丝粒蛋白-C和着丝粒蛋白-E的存在。
图1 端粒定位染色体截断技术（图片暂缺）

2． HAC载体表达系
近年来，研究者利用上述HAC构建了不同的基因表达系统，取得令人鼓舞的成果。目前，目的基因的插入主要基于如下几种策略：(1)共转染;(2)应用Cre/loxP和FLP-FRT系统进行位点特异性重组;(3)染色体克隆技术[3，4]。Kuroiwa等将Cre/LoxP介导的位点特异性重组技术同端粒定位染色体截断技术相结合，发展了染色体克隆技术（图2），使精确地插入特定染色体区段成为可能。Grimes等[5]将21号染色体的α卫星DNA和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（HPRT）全序列引入PAC中，构建了HAC。然后，转染HPRT缺陷细胞，在缺乏选择压力的条件下，HPRT基因能够持续表达60天。还有研究者构建了一404 kb的HAC，包括人类17号染色体着丝粒α卫星DNA序列、人染色体端粒、HPRT基因全序列，将其转染至HPRT缺陷的HT1080细胞，该染色体载体表现出很高的有丝分裂稳定性且目的基因持续表达60天。Auriche等[6]将囊性纤维化跨膜转导调节因子基因（CFTR）全序列及其上游调控序列插入HAC中，成功地检测到了该基因的转录和翻译产物。Ikeno等[7]将携带三磷酸鸟苷酸环化水解酶基因（GCH1）全序列（包括编码序列和调控区）的BAC，与包含α卫星DNA序列的BAC共转染，进入人类成纤维细胞内，筛选出携带GCH1基因的HAC克隆，分析结果表明，这些HAC表现出很高的有丝分裂稳定性，且GCH1水平明显提高，并对IFN-γ的刺激高度敏感。Kuroiwa等[4]将包含免疫球蛋白基因（Ig）位点的hCF导入小鼠，构建了数个转染色体小鼠系，从中筛选出包含有SC20载体（是来自于人类第14号染色体的hCF，其上有Ig重链基因位点）的细胞系，然后应用“染色体克隆”技术，使携带目的基因的人类染色体与SC20载体在雏鸡DT40细胞中发生位点特异性同源重组，成功地构建了只包含特定染色体区域的HAC，这些HAC分别稳定地表达Igλ，Igκ，Igμ以及细胞色素P450，且表现出很高的有丝分裂稳定性。Robl等[8]也进行了类似的研究。