生命科学中的FISH （“钓鱼”）技术

发展历史
荧光原位杂交技术(fluorescence in situ Hybridization,FISH)问世于70年代后期,其曾多用于染色 体异常的研究,近年来随着FISH所应用的探针种类的不断增多,特别是全COSMID探针及染色体原位抑制杂交技 术的出现,使FISH技术不仅在细胞遗传学方面,而且还广泛应用于肿瘤学研究,如诊断、基因定位等

放射性同位素原位杂交技术
原有的放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺点，诸如每次检验需重新标记 、已标记的探针表现出明显的不稳定性 、需要较长时间的曝光时间和对环境的污染等。在观察结果时，需要较多的分裂相进行统计学分析。此外，由于放射性银粒和染色体聚集的不同平面，可能引起计数上的误差等。

FISH的基本原理
很简单, 就是标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的DNA(玻片上的标本)退火杂交, 通过观察荧光信号在染色体上的位置来反映相应基因的情况.

荧光原位杂交（FISH）
FISH技术是常规染色体分析的辅助手段。它是用荧光素标记特异探针，与染色体做杂交后，根据特异的荧光信号来判断结果。
它可用于标记染色体的识别、特异融合基因的检测、新基因定位，用全染色体涂抹探针识别复杂的染色体结构异常。

FISH具有其不可比拟的优点：
1.操作简便，探针标记后稳定，一次标记后可使用二年。
2.方法敏感，能迅速得到结果。
3.在同一标本上，可同时几种不同探针。
4.不仅可用于分裂细胞染色体数量或结构变化的研究，而且还可用于静止期细胞的染色体数量及基因改变的研究。

FISH的技术特点：
FISH选用的标本可以是分裂期细胞染色体也可以是间期细胞。间期细胞可以是冰冻切片，也可以是细胞滴片或印片。
生物 素（Biotin）地高辛（digoxigenin ）, dinitrophenyl(DNP)，aminoacetyl fluorene(AAF)均可用于探针标记。

直接标记和间接标记
用 生物 素或地高辛标记称为间接标记, 杂交后需要通过免疫荧光抗体检测方能看到荧光信号, 因而 步骤较多, 操作麻烦, 其优点是在信号较弱或较小时可经抗原抗体反应扩大
直接用荧光素标记DNA的方法称为直接标记. 由于直接标记的探针杂交后可马上观察到荧光信号, 省去了烦琐的免疫荧光反应, 不再需要购买荧光抗 体, 也由于近年来荧光素的亮度和抗淬灭性的不断改进和提高, 直接标记的荧光探针越来越成为首选, 并采用多种不同颜色的荧光, 方便在同一标本上同时检测多种异常. 其荧光强度 和信号大小都易于在普通 荧光显微镜 下观察, 使FISH过程变得简便而易于操作.

探针标记
在已知探针DNA结构及序列情况下可采用PCR或RNA逆转录法标探针。通常用Biotin标记的探针应大于100bp，较小的探针可采用PCR技术来标记。
近年来，VYSIS公司成功的生 产了大片段的DNA探针（100─400kb）。由于探针较长，故可将荧光物质直接标记在核苷酸上，这不仅使杂交过程进一步简化面且杂交信号增强。

染色体着丝粒荧光

染色体端粒荧光

多色信号采集
常规的 荧光显微镜 的荧光显微镜的照像， 彩色胶片不易多次曝光，限制了这种联合标记探针的应用，使用CCD照像系统，先分别多次摄取灰色的影像关储存在计算机内，而后冠以人为的颜色，运用软件系统融合各次得到的影像，最终形成一个复合的多颜色的图像。