医学遗传学综合实验
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一、实验目的
1．掌握利用系谱与DNA检测所得到的信息相结合用于产前基因诊断的方法；
2．了解DNA分析技术在遗传病产前基因诊断中的应。
二、实验原理
（一）PCR-RFLP分析技术
PCR-RFLP分析技术是在PCR技术基础上，根据限制性内切酶识别位点改变而导致的酶切位点增加或消失的特点，对DNA进行鉴定；利用PCR特异扩增的 DNA片断中包含某个碱基突变，经特定限制酶切割后, 通过凝胶电泳分离酶切产物大小，比较分析与对照样本的异同，判断该DNA是否存在突变。应用PCR-RFLP分析技术可以检测已知的点突变，也可以在家系中连锁分析进行基因诊断。
（二）FⅧ基因
FⅧ基因位于人类染色体Xq28，长186kb，由26个外显子及25个内含子组成。根据FⅧ基因序列，本实验利用PCR结合RFLP设计了一对特异性引物，首先扩增出FⅧ基因长度为142bp的特异性片段，然后选择 Bcl Ⅰ限制性核酸内切酶对扩增产物进行消化，野生型基因拥有限制性核酸内切酶 Bcl Ⅰ的酶切位点，可被切为99bp和43bp两个片段；而突变型基因没有限制性核酸内切酶 Bcl Ⅰ的酶切位点，不会被 Bcl Ⅰ切断，酶解后仍为142bp的片段；如果酶解后142bp、99bp和43bp片段均出现，说明是野生型基因与突变型基因的杂合子。
（三）血友病A病例
姓名：李XX 性别：男 出生日期：1979年5月
民族：汉 现住址：XXXXXX
就诊日期：2000年7月（XX医科大学XX临床学院血液室）
主诉：反复出血不止、关节肿痛15年，加重1年
现病史：15年前，于轻微外伤后出血不止，外用凝血药止血后未予治疗。此后齿龈、舌、口腔、鼻经常出血，而膝、踝、肘等部位常于轻微外伤后出现淤斑、关节肿痛，症状逐年加重。
查体：神志清楚，语言流利，贫血貌，膝、踝、肘关节僵硬变形，肌肉萎缩。
实验室检查：①凝血时间延长；②凝血活酶时间显著延长；③血浆中抗血友病球蛋白减少；④出血时间、凝血酶源时间、纤维蛋白原含量、毛细血管脆性及血小板数均正常。
【注：血浆因子Ⅷ活性的正常均值定为100％（范围50％～200％）。甲型血友病血浆因子Ⅷ活性水平低于5％，重型＜2％。】
家族史：家系中两个舅舅曾患类似病死亡，现有一同胞弟弟患有同病，同胞现年7岁，已出现出血时间延长，出血不止症状。
三、实验准备（材料、试剂、 仪器 ）
（一）试剂
1．模板DNA（50ng/μl）、引物Ⅰ和Ⅱ（20μΜ）、TaqDNA聚合酶（5u/μl）、10XPCR反应缓冲液、dNTP（2.5mM）、灭菌蒸馏水、矿物油、限制性内切酶 Bcl Ⅰ(20Ｕ/μl)、10X酶切缓冲液。
2．30%非变性聚丙烯酰胺凝胶（29∶1）、5XTBE、2%过硫酸铵、TEMED、6X上样缓冲液、DNA分子量标记、5mg/ml溴化乙锭（EB）染液、无水乙醇
（三） 仪器 和设备
PCR自动热循环仪、紫外透射仪、微量加样器、枪头及离心管、容器盒、恒温水浴箱、制胶玻璃板、制胶架、聚丙烯酰胺凝胶电泳装置、5ml注射器、12号针头、25μl玻璃注射器、烧杯、脱脂棉、保鲜膜、染色盒、微波炉、250ml三角烧瓶、透明胶带、称药盘、天平。
1．掌握利用系谱与DNA检测所得到的信息相结合用于产前基因诊断的方法；
2．了解DNA分析技术在遗传病产前基因诊断中的应。
二、实验原理
（一）PCR-RFLP分析技术
PCR-RFLP分析技术是在PCR技术基础上，根据限制性内切酶识别位点改变而导致的酶切位点增加或消失的特点，对DNA进行鉴定；利用PCR特异扩增的 DNA片断中包含某个碱基突变，经特定限制酶切割后, 通过凝胶电泳分离酶切产物大小，比较分析与对照样本的异同，判断该DNA是否存在突变。应用PCR-RFLP分析技术可以检测已知的点突变，也可以在家系中连锁分析进行基因诊断。
（二）FⅧ基因
FⅧ基因位于人类染色体Xq28，长186kb，由26个外显子及25个内含子组成。根据FⅧ基因序列，本实验利用PCR结合RFLP设计了一对特异性引物，首先扩增出FⅧ基因长度为142bp的特异性片段，然后选择 Bcl Ⅰ限制性核酸内切酶对扩增产物进行消化，野生型基因拥有限制性核酸内切酶 Bcl Ⅰ的酶切位点，可被切为99bp和43bp两个片段；而突变型基因没有限制性核酸内切酶 Bcl Ⅰ的酶切位点，不会被 Bcl Ⅰ切断，酶解后仍为142bp的片段；如果酶解后142bp、99bp和43bp片段均出现，说明是野生型基因与突变型基因的杂合子。
（三）血友病A病例
姓名：李XX 性别：男 出生日期：1979年5月
民族：汉 现住址：XXXXXX
就诊日期：2000年7月（XX医科大学XX临床学院血液室）
主诉：反复出血不止、关节肿痛15年，加重1年
现病史：15年前，于轻微外伤后出血不止，外用凝血药止血后未予治疗。此后齿龈、舌、口腔、鼻经常出血，而膝、踝、肘等部位常于轻微外伤后出现淤斑、关节肿痛，症状逐年加重。
查体：神志清楚，语言流利，贫血貌，膝、踝、肘关节僵硬变形，肌肉萎缩。
实验室检查：①凝血时间延长；②凝血活酶时间显著延长；③血浆中抗血友病球蛋白减少；④出血时间、凝血酶源时间、纤维蛋白原含量、毛细血管脆性及血小板数均正常。
【注：血浆因子Ⅷ活性的正常均值定为100％（范围50％～200％）。甲型血友病血浆因子Ⅷ活性水平低于5％，重型＜2％。】
家族史：家系中两个舅舅曾患类似病死亡，现有一同胞弟弟患有同病，同胞现年7岁，已出现出血时间延长，出血不止症状。
三、实验准备（材料、试剂、 仪器 ）
（一）试剂
1．模板DNA（50ng/μl）、引物Ⅰ和Ⅱ（20μΜ）、TaqDNA聚合酶（5u/μl）、10XPCR反应缓冲液、dNTP（2.5mM）、灭菌蒸馏水、矿物油、限制性内切酶 Bcl Ⅰ(20Ｕ/μl)、10X酶切缓冲液。
2．30%非变性聚丙烯酰胺凝胶（29∶1）、5XTBE、2%过硫酸铵、TEMED、6X上样缓冲液、DNA分子量标记、5mg/ml溴化乙锭（EB）染液、无水乙醇
（三） 仪器 和设备
PCR自动热循环仪、紫外透射仪、微量加样器、枪头及离心管、容器盒、恒温水浴箱、制胶玻璃板、制胶架、聚丙烯酰胺凝胶电泳装置、5ml注射器、12号针头、25μl玻璃注射器、烧杯、脱脂棉、保鲜膜、染色盒、微波炉、250ml三角烧瓶、透明胶带、称药盘、天平。
