金免疫测定

本节介绍的两种方法（斑点金免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验）是在以上两种方法的基础上发展形成的，均以硝酸纤维素膜为固相载体，以免疫金为结合物。因其最大特点是简便快速，故统称为快速斑点免疫结合试验。
　　一、斑点金免疫渗滤试验
　　斑点免疫渗滤试验的基本原理是：以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成。斑点免疫渗滤试验最初是从斑点ELISA基础上发展起来建立的，应用的结合物是酶标记的，称为斑点酶免疫渗滤试验。90年代初发展了以胶体金为标记物的斑点免疫渗滤试验（dotymmunogoldfiltrationassay，DIGFA），又名滴金免疫测定法（简称滴金法）。在滴金法中不需酶对底物的反应，更加简便、快速，在临床检验中应用日渐广泛。
　　（一）原理
　　以双抗体夹心法为例。在硝酸纤维素膜的膜片中央滴加纯化的抗体，为膜所吸附。当滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中含抗原被膜上抗体捕获，其余无关蛋白等没滤出膜片。其后加入的胶体金标记也在渗滤中与已结合在膜上的抗原相结合。因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央显示红色斑点。
　　（二）试剂和操作
　　1．渗滤装置渗滤装置是滴金法测定中的主要试剂成分之一，由塑料小盒、吸水垫料和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成。塑料小盒可以是多种形状的，盒盖的中央有一直径约0.4～0.8cm的小圆孔，盒内垫放吸水垫料，硝酸纤维素膜片安放在正对盒盖的中央有一直径约0.40.8cm的小圆孔，盒的垫放吸水塑料，硝酸纤维素膜片安放在正对盒的圆孔下，紧密关闭盒盖，使硝酸纤维素膜片贴紧吸水垫料。如此即制备成一渗滤装置（图19-1）。塑料小盒的形状最多见的是扁平的长方形小板，加之滴金法的整个反应过程都是在渗滤装置上进行的，因此又常称渗滤装置为滴金法反应板。
　　2．试剂盒组成滴金法试剂盒的三个基本试剂成分是滴金法反应板、免疫金复合和洗涤液。为了提供质控保证，用于抗原测定的试剂盒还应包括抗原参照品，相应的检测抗体的试剂盒应有阳性对照品。
　　3．测定操作以双抗体夹心法为例，具体步骤如下：
　　（1）将反应板平放于实验台上，于小孔内滴加血清标本1～2滴，待完全渗入。
　　（2）于小孔内滴加免疫金复合物试剂1～2滴，待完全渗入。
　　（3）于小孔内滴加洗涤液2～3滴，待完全渗入。
　　（4）判读结果：在膜中央有清晰的淡红色斑点显示者判为阳性反应；反之，则为阴性反应。斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。
　　（三）质量控制 免疫学实验技术论坛   http://bbs.bbioo.com/forum-140-1.html
　　滴金法的质量控制常采用在硝酸纤维素膜上点加质控点的方法。质控小圆点多位于反应斑点的正下方。双抗体夹心法的质控点最好是相应抗原，若该抗原试剂不易制备或价格昂贵时，也可用SPA或针对金标抗体的抗抗体来充当。间接法的质控点采用盐析法粗提的人IgG最为经济、方便。


图19-1 DIGFA渗滤装置及操作示意图
A：操作示意图B:装置分解图
　　有将包被斑点由圆点改成短线条式的：质控斑点横向包被成横线条，如“－”；反应斑点纵向包被成竖线条，如“∣”；两者相交成“＋”。这样，阳性反应结果在膜上显示红色的正号（＋），阴性反应结果则为负号（－），目视判断直观、明了。