蛋清溶菌酶的制备及活力测定
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一、实验目的
1.熟悉溶菌酶的功能、分布以及作用特性。
2.掌握溶菌酶的提取及活力测定方法。
二、实验原理
溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种碱性糖苷水解酶，能作用于细菌细胞壁的粘多糖，具有杀菌等作用，广泛应用于医学临床。
溶菌酶存在于植物浆及动物(蛋清、血浆、淋巴液和鼻粘膜等处)组织中，其中鸡蛋清中含量较为丰富，且鸡蛋清取材方便，因此实验室及实际生产中一般以鸡蛋清为原料进行溶菌酶的提取制备。
从鸡蛋清中分离溶菌酶可以选用多种不同的方法和步骤。本实验采用的分离纯化步骤为：等电点及热变性选择性沉淀→聚丙烯酸处理→葡聚糖凝胶柱层析→聚乙二醇浓缩。溶菌酶具有耐热性，在酸性条件下经受长时间高温处理而不丧失活性；而且溶菌酶又具有特别高的等电点，因此采用热变性与
等电点沉淀相结合的方法可除去大部分的杂蛋白。聚丙烯酸是一种多聚蛋白质，在酸性条件下可以与溶菌酶结合形成凝聚物；当有钙离子存在时溶菌酶又能从这种凝聚物中分离出来，同时生成丙烯酸钙沉淀，后者经过硫酸的酸化又重新形成聚丙烯酸。在实验中，一旦提取液中溶菌酶与聚丙烯酸结合，所形成的凝聚物会立即粘附于试管的底部，倾去上层液体可使溶菌酶既得到纯化，又得到浓缩。最后再用葡聚糖凝胶柱层析，使杂蛋白、溶菌酶和钙离子分开。
三、 仪器 和试剂
仪器
玻璃层析柱(2.5cm×34cm)、电热恒温水浴锅、离心沉淀机、10μL 微量进样器、721型分光光度计。
试剂
1. Sephadex G-50
2. 1%NaCl—0.05mol/LHCl
3. 20%HAc
4. 10%聚丙烯酸(现配现用)
5. 0.5mol/LNa 2 CO 3
6. 500g/LCaCl 2
7. NaCl
8. 6g/LNaCl
9. 饱和草酸溶液；
10. 细菌悬液：取1g 艳红K-2BP 标记的微球菌M.lysodeikticus 悬于100mL0.5mol/L 的pH6.5磷酸缓冲液中，置于冰箱内保存备用。
11. 乳化剂：2g Brij-35(聚氧乙烯脂肪醇醚)加50mL 蒸馏水微热使溶解，冷却后定容至100mL。吸取此液10mL 用0.6mol/LHCl 定容至200mL 备用。
12. 0.5mol/L 的pH6.5磷酸缓冲液。
四、操作步骤
(一)蛋清溶菌酶的分离提取
1.变性与等电点选择性沉淀：取新鲜蛋清用1%NaCl-0.05mol/LHCl 溶液搅拌稀释，加20%HAc 调至pH4.6，3000r/min 离心10min，收集滤液并记录体积，留样2mL(Ⅰ)待分析。将滤液置于沸水浴使3min 内迅速升温至75℃，用流动水速冷后，3000r/min 离心20min，收集上清液，纪录体积，并留样2mL(Ⅱ)待分析。
2.丙烯酸处理：将所得清液(pH6.0左右)中滴加10%聚丙烯酸(用量为清液体积的1/4)，慢速搅拌，当凝聚物出现后，静置30min 使凝聚物粘附于容器底部。倾去上清液，加入蒸馏水约1mL，并滴加少量0.5mol/LNa 2 CO 3 ，使沉淀溶解，此时溶液pH6左右。搅拌条件下向溶液中滴加500g/LCaCl 2 (体积为聚丙烯酸量的1/12.5)，生成的沉淀挤压干后弃去。如所得溶液不够澄清，可以进行离心或简单过滤，并用少量水洗涤滤纸。收集滤液于刻度 试管 ，记录体积，留样0.5mL(Ⅲ)待分析。
3.Sephadex G-50 柱层析
(1)装柱：称取15g Sephadex G-50，加入300mL 蒸馏水溶胀6小时以上，置热 水浴 中加热除去气泡，冷却后装入玻璃层析柱。用6g/LNaCl 溶液200mL 平衡层析柱。
(2)上样：向样液中加入固体NaCl 使终浓度为50g/L，上样时先吸去层析柱凝胶面上的溶液，再沿管壁滴加样品，样品量不宜超过10mL。加完后打开层析柱出口，让样品均匀流入凝胶内。
(3)洗脱：样品流完后，先分次加入少量6g/LNaCl 洗脱液洗下柱壁上的样品，然后接通蠕动泵，继续6g/LNaCl 洗脱，调节操作压力使流速控制在7~8mL/10min，部分收集器收集，10min 一管，共收集200mL 左右。
(4)分析：纪录各管体积，紫外光吸收法测定各管中蛋白质浓度。合并含有蛋白质的收集管，草酸鉴定Ca 2+ ，留样(Ⅳ)待分析。
4.乙二醇浓缩：将洗脱液放入透析袋，外面裹以聚乙二醇，置于加盖容器中。当酶液水分被聚乙二醇吸收而浓缩至5mL 左右时，用 蒸馏 水洗去透析膜外的聚乙二醇，倒出浓缩液，记录体积，留样
0.5mL(Ⅴ)待分析。
(二)溶菌酶活力测定
取上述各待测酶液稀释30~50倍，进行酶活测定。用微量进样器取酶液样品10μL，加入0.5mL 的0.5mol/L 磷酸缓冲液(pH6.5)，混合均匀，37℃预热2min，然后加入同样已预热过的菌悬液0.5mL。37℃保温反应15min 后，用2mL 乳化剂停止反应。
反应液经3000r/min 离心10min，取清液在721型 分光光度计 上进行比色(540nm)。空白管用磷酸 缓冲液 替代样液。
1.熟悉溶菌酶的功能、分布以及作用特性。
2.掌握溶菌酶的提取及活力测定方法。
二、实验原理
溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种碱性糖苷水解酶，能作用于细菌细胞壁的粘多糖，具有杀菌等作用，广泛应用于医学临床。
溶菌酶存在于植物浆及动物(蛋清、血浆、淋巴液和鼻粘膜等处)组织中，其中鸡蛋清中含量较为丰富，且鸡蛋清取材方便，因此实验室及实际生产中一般以鸡蛋清为原料进行溶菌酶的提取制备。
从鸡蛋清中分离溶菌酶可以选用多种不同的方法和步骤。本实验采用的分离纯化步骤为：等电点及热变性选择性沉淀→聚丙烯酸处理→葡聚糖凝胶柱层析→聚乙二醇浓缩。溶菌酶具有耐热性，在酸性条件下经受长时间高温处理而不丧失活性；而且溶菌酶又具有特别高的等电点，因此采用热变性与
等电点沉淀相结合的方法可除去大部分的杂蛋白。聚丙烯酸是一种多聚蛋白质，在酸性条件下可以与溶菌酶结合形成凝聚物；当有钙离子存在时溶菌酶又能从这种凝聚物中分离出来，同时生成丙烯酸钙沉淀，后者经过硫酸的酸化又重新形成聚丙烯酸。在实验中，一旦提取液中溶菌酶与聚丙烯酸结合，所形成的凝聚物会立即粘附于试管的底部，倾去上层液体可使溶菌酶既得到纯化，又得到浓缩。最后再用葡聚糖凝胶柱层析，使杂蛋白、溶菌酶和钙离子分开。
三、 仪器 和试剂
仪器
玻璃层析柱(2.5cm×34cm)、电热恒温水浴锅、离心沉淀机、10μL 微量进样器、721型分光光度计。
试剂
1. Sephadex G-50
2. 1%NaCl—0.05mol/LHCl
3. 20%HAc
4. 10%聚丙烯酸(现配现用)
5. 0.5mol/LNa 2 CO 3
6. 500g/LCaCl 2
7. NaCl
8. 6g/LNaCl
9. 饱和草酸溶液；
10. 细菌悬液：取1g 艳红K-2BP 标记的微球菌M.lysodeikticus 悬于100mL0.5mol/L 的pH6.5磷酸缓冲液中，置于冰箱内保存备用。
11. 乳化剂：2g Brij-35(聚氧乙烯脂肪醇醚)加50mL 蒸馏水微热使溶解，冷却后定容至100mL。吸取此液10mL 用0.6mol/LHCl 定容至200mL 备用。
12. 0.5mol/L 的pH6.5磷酸缓冲液。
四、操作步骤
(一)蛋清溶菌酶的分离提取
1.变性与等电点选择性沉淀：取新鲜蛋清用1%NaCl-0.05mol/LHCl 溶液搅拌稀释，加20%HAc 调至pH4.6，3000r/min 离心10min，收集滤液并记录体积，留样2mL(Ⅰ)待分析。将滤液置于沸水浴使3min 内迅速升温至75℃，用流动水速冷后，3000r/min 离心20min，收集上清液，纪录体积，并留样2mL(Ⅱ)待分析。
2.丙烯酸处理：将所得清液(pH6.0左右)中滴加10%聚丙烯酸(用量为清液体积的1/4)，慢速搅拌，当凝聚物出现后，静置30min 使凝聚物粘附于容器底部。倾去上清液，加入蒸馏水约1mL，并滴加少量0.5mol/LNa 2 CO 3 ，使沉淀溶解，此时溶液pH6左右。搅拌条件下向溶液中滴加500g/LCaCl 2 (体积为聚丙烯酸量的1/12.5)，生成的沉淀挤压干后弃去。如所得溶液不够澄清，可以进行离心或简单过滤，并用少量水洗涤滤纸。收集滤液于刻度 试管 ，记录体积，留样0.5mL(Ⅲ)待分析。
3.Sephadex G-50 柱层析
(1)装柱：称取15g Sephadex G-50，加入300mL 蒸馏水溶胀6小时以上，置热 水浴 中加热除去气泡，冷却后装入玻璃层析柱。用6g/LNaCl 溶液200mL 平衡层析柱。
(2)上样：向样液中加入固体NaCl 使终浓度为50g/L，上样时先吸去层析柱凝胶面上的溶液，再沿管壁滴加样品，样品量不宜超过10mL。加完后打开层析柱出口，让样品均匀流入凝胶内。
(3)洗脱：样品流完后，先分次加入少量6g/LNaCl 洗脱液洗下柱壁上的样品，然后接通蠕动泵，继续6g/LNaCl 洗脱，调节操作压力使流速控制在7~8mL/10min，部分收集器收集，10min 一管，共收集200mL 左右。
(4)分析：纪录各管体积，紫外光吸收法测定各管中蛋白质浓度。合并含有蛋白质的收集管，草酸鉴定Ca 2+ ，留样(Ⅳ)待分析。
4.乙二醇浓缩：将洗脱液放入透析袋，外面裹以聚乙二醇，置于加盖容器中。当酶液水分被聚乙二醇吸收而浓缩至5mL 左右时，用 蒸馏 水洗去透析膜外的聚乙二醇，倒出浓缩液，记录体积，留样
0.5mL(Ⅴ)待分析。
(二)溶菌酶活力测定
取上述各待测酶液稀释30~50倍，进行酶活测定。用微量进样器取酶液样品10μL，加入0.5mL 的0.5mol/L 磷酸缓冲液(pH6.5)，混合均匀，37℃预热2min，然后加入同样已预热过的菌悬液0.5mL。37℃保温反应15min 后，用2mL 乳化剂停止反应。
反应液经3000r/min 离心10min，取清液在721型 分光光度计 上进行比色(540nm)。空白管用磷酸 缓冲液 替代样液。
